专利名称：一种获得抗真菌病害植物的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种获得抗真菌病害植物的方法。
背景技术：
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的棉花病害，也是制约我国棉花生产的主要病害。黄萎病菌能够在短时间内引起棉花产生枯黄、萎蔫的病状，造成棉苗大面积死亡，致使农民遭遇减产甚至绝收。利用传统的育种方法来进行抗病种质的筛选，不仅种质资源缺乏、周期长，而且还存在着抗病性不稳定等问题，难以取得突破性进展。因此，筛选抗病基因并研究其对黄萎病的抗病机制，利用基因工程手段，通过抗病基因的克隆和转化来改良棉花的黄萎病抗性，是棉花抗黄萎病育种的一个重要方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种 获得抗真菌病害植物的方法。本发明提供了 GhMLPl蛋白在调控植物抗病性中的应用；所述GhMLPl蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。所述抗病可为抗真菌病害。所述真菌具体可为大丽轮枝菌(如大丽轮枝菌V991)或黑胫病菌(如烟草黑胫病菌)。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为烟草，如 Nicotiana tabacum L.(cv.Petit havana SRI)。本发明还提供了 GhMLPl蛋白的编码基因在培育抗病植物中的应用；所述GhMLPl蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。所述GhMLPl蛋白的编码基因为如下⑴或⑵或(3)或⑷或(5)所述的DNA分子:(I)序列表中序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表中序列2自5’末端第57至530位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表中序列2所示的DNA分子；(4)在严格条件下与(I)或⑵或(3)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子；(5)与(I)或⑵或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件为在0.1XSSPE(或0.1 X SSC), 0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。所述抗病可为抗真菌病害。所述真菌具体可为大丽轮枝菌(如大丽轮枝菌V991)或黑胫病菌(如烟草黑胫病菌)。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为烟草，如 Nicotiana tabacum L.(cv.Petit havana SRI)。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将GhMLPl蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物；所述GhMLPl蛋白是如下(a)或
(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。所述GhMLPl蛋白的编码基因为如下⑴或⑵或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子:(1)序列表中序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表中序列2自5’末端第57至530位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表中序列2所示的DNA分子；(4)在 严格条件下与⑴或⑵或(3)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子；(5)与(I)或⑵或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.1 X SSPE (或0.1 X SSC), 0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。所述GhMLPl蛋白的编码基因可通过重组载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化所述目的植物的细胞或组织。所述重组载体为将所述GhMLPl蛋白的编码基因插入骨架载体的多克隆位点得到的重组质粒。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的3 ’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选。所述重组载体具体可为将所述GhMLPl蛋白的编码基因插入载体PPZP-GFP的多克隆位点得到的重组质粒。所述抗病可为抗真菌病害。所述真菌具体可为大丽轮枝菌(如大丽轮枝菌V991)或黑胫病菌(如烟草黑胫病菌)。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为烟草，如 Nicotiana tabacum L.(cv.Petit havana SRI)。本发明对于培育抗病植物，特别是抗真菌病害的植物具有重大价值。备注:本发明由农业部“转基因生物新品种培育重大专项”(课题号:2009ZX08005-001B ；2009ZX08010-001B)资助。
图1为GhMLPl基因在不同组织器官中的表达特征。图2为GhMLPl基因对不同激素(水杨酸、茉莉酸、乙烯)的应答。图3为烟草离体叶片的大丽轮枝菌抗性分析。图4为烟草植株的大丽轮枝菌抗性分析。图5为烟草植株的黑胫病抗性分析。图6为接种烟草黑胫病菌9天后烟草的根部及叶片的症状比较。图7为烟草抗病相 关基因的转录表达分析。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的陆地棉(Gossypium hirsutum)品种为BD18,大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)菌株为V991 ;陆地棉BD18和大_轮枝菌V991公众均可从中国科学院微生物研究所获得；提及陆地棉BD18和大丽轮枝菌V991的参考文献:Qu ZL, WangHY, Xia GX, (2006)Ecotopic expression of the cotton nonsymbiotic hemoglobingene GhHbl triggers defense responses and increases disease tolerance inArabidopsis.Plant Cell Physiol.47:1058-1068。农杆菌EHA105:公众均可从中国科学院微生物研究所获得；参考文献:Hood EE,Gelvin SB, Melchers LS, Hoekema A.(1993)New Agrobacterium helper plasmids forgene transfer to plants.Transgenic Res, 2:208_218o实施例中所用的烟草为Nicotiana tabacum L.(cv.Petit havana SRI),实施例中又称为野生型植株，公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献=Ivana T，Stanisavl jevic ML, Lazic VB, Veljkov1.(2007)Ultrasonic extraction of oil fromtobacco(Nicotiana tabacum L.) seeds.Ultrasonics Sonochemistry 14(5):646-652。载体pPZP-GFP:公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献:马银平，沈法富，夏桂先，王付欣，杨淳淋(2012).海岛棉几丁质酶基因GbCHI的克隆与功能分析.遗传，V34⑵。烟草黑胚病菌(Phytophtoraparasitica var.nicotianae Tucker):贵州省烟草科学研究所。实施例1、植物黄萎病抗性相关蛋白GhMLPl及其编码基因的发现利用SSH差异显示方法，从陆地棉BD18中分离到黄萎病菌侵染应答的62号克隆。根据62号克隆的序列进行EST搜索，通过电子拼接，设计引物，以棉花cDNA为模板进行PCR扩增，得到一条含有完整ORF的序列，编码序列表的序列I所示的蛋白。蛋白比对结果表明，该蛋白含有Bet V I功能域，属于Bet V I家族MLP亚家族。将序列表的序列I所不的蛋白质命名为GhMLPl蛋白。将编码GhMLPl蛋白的基因命名为GhMLPl基因，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示。实施例2、GhMLPl基因的转录表达分析一、GhMLPl基因在棉花不同组织器官中的表达特征分析为了分析GhMLPl基因在不同组织器官中的表达特征，分别提取陆地棉BD18的根、茎、叶、花的总RNA并反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR分析，结果见图1。结果表明，GhMLPl基因在根、茎、叶、花中都有表达，在根和茎中的表达量较高且相近。GhMLPl基因可能在棉花各器官中都能够发挥作用，尤其在根和茎中可能有重要功能。二、GhMLPl基因对不同激素(水杨酸、茉莉酸、乙烯)的应答为了分析GhMLPl基因是否参与了依赖激素的相关防御途径，用水杨酸、茉莉酸和乙烯处理水培棉花植株，分别在处理前(O小时)，处理后3、4.5、6小时取样。提取样品的总RNA并反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR分析，结果见图2。图2中，A为水杨酸处理，B为茉莉酸处理，C为乙烯处理。水杨酸处理后GhMLPl基因转录水平降低，而茉莉酸和乙烯处理后GhMLPl基因转录水平升高。推测GhMLPl基因能够对多种植物防御相关激素产生应答，在植物体内可能受它·们的综合调控。实施例3、转基因植物的获得和鉴定一、重组表达载体的构建1、GhMLP I基因的克隆提取陆地棉BD18的总RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Primer-F和Primer-R组成的弓I物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收500bp左右的目的片段(序列表中序列2自5’末端第56至530位核苷酸所示的GhMLPl基因)。Primer-F:5’ -AAAGGATCCATGACGTCTTCAGCTCTGACAGG-3’ (下划线标注 BamH I 酶切识别位点)；Primer-R:5，-AAAGAGCTCTCA TTAACTTGCTTGGGTGAGGT-3’(下划线标注 Sac I 酶切识别位点)。PCR 扩增体系(20 μ I):含有 10XLA Buffer 5 μ 1，MgCl22.5mmol/L, Primer-F 与Primer-R 各 0.3 μ mol/L, dNTP 0.2mmol/L, LA Taq 3U, cDNA 模板 0.4 μ g ;试剂和酶均购自Takara 公司。PCR 扩增条件:95°C热变性 3min ；94°C 30s,58°C 30s, 72°C 30s，20 个循环；最后72°C延伸 lOmin。2、重组表达载体的构建①用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切步骤I回收的目的片段，回收酶切产物。②用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切载体pPZP_GFP，回收载体骨架(约
9.9kb)。③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下:在载体pPZP-GFP的BamH和Sac I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的GhMLPl基因。二、转基因植物的获得1、重组农杆菌的获得用步骤一得到的重组质粒转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。2、转基因烟草的获得利用重组农杆菌，通过叶盘转化法(HorschR., Fry J., Hoffmann N., EichholtzD., Rogers S., Fraley R.(1985)A simple and genaral method for transferring genesinto plants.Science N.Y.227，1129-1136)将重组质粒导入烟草，得到Tl代种子。
Tl代种子收获后在MS培养基(含有50mg/L的卡那霉素)中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，自交并收获T2代种子。将T2代种子培育为植株(T2代植株)。分别提取Tl代植株和T2代植株的叶片的总RNA并反转录为cDNA，用Primer-F和Primer-R组成的引物对对来自各个样本的cDNA进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。对于某一 Tl代植株，如果其T2代植株均PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转基因植株，该植株及其后代即为I个纯合的转基因株系。T2代转基因植株自交产生T3代种子。随机选取一个转基因株系(株系I)的T3代种子进行步骤四的鉴定。随机选取三个转基因株系(株系1、株系2和株系3)的T3代种子进行步骤五的鉴定。三、转空载体植株的获得用载体pPZP-GFP代替重组质粒，其它同步骤二，得到转空载体植株的T3代种子。四、转基因烟草对大丽轮枝菌的抗性分析1、离体叶片的大丽轮枝菌抗性分析转基因植株的T3代植株(100株)、转空载体植株的T3代T3代植株(100株)、野生型植株的T3代植株(100株)，分别进行如下抗病性鉴定(平行试验):从培养两月的健康烟草植株上取下完全展开的叶片(从顶端向下第3片)，用大丽轮枝菌进行非通透划伤接种，保持叶片湿润，7天后观察离体叶片的生长情况。结果见图3。野生型植株的离体叶片在接种点附近因感病而失绿变黄，叶片坏死区域较大。转基因烟草的离体叶片仅在接种点附近略微褪色变黄。野生型植株和转空载体植株的离体叶片表型没有显著差异。上述结果表明，侵染后，转基因植株对大丽轮枝菌的抗侵染能力显著优于野生型植株。2、植株的大丽轮枝菌抗性分析转基因植株的T3代植株种子(100粒)，转空载体植株的T3代种子(100粒)，野生型植株的种子(100粒)，分别进行如下抗病性鉴定(平行试验):将的种子播种在1/2MS培养基平板上，萌发7天后移栽至土壤培养三周，然后用大丽轮枝菌V991菌液(I X IO7个孢子/毫升)进行灌根接种，持续观察植株的生长情况，接种6天后拍照。野生型植株接种大丽轮枝菌后地上部明显萎蔫，且萎蔫症状在一周内都持续存在，此后恢复健康生长。转基因烟草接种大丽轮枝菌后最初出现轻微萎蔫症状，2天后即可恢复正常生长状态。野生型植株和转空载体植株的生长状态没有显著差异。接种6天后的照片见图4。结果表明，转基因植株在大丽轮枝菌侵染后的抗病能力显著优于野生型植株，具有较强抗侵染能力。五、转基因烟草对烟草黑胫病菌的抗性分析转基因植株的T3代植株种子(每个株系100粒)，转空载体植株的T3代种子(100粒)，野生型植株的种子(100粒)，分别进行如下抗病性鉴定(平行试验):将种子播种在1/2MS培养基平板上，萌发7天后移栽至土壤培养三周，然后用烟草黑胫病菌进行土埋菌丝接种(在0.5cm厚的淀粉培养基平板上培养烟草黑胫病菌，菌丝生长饱和后，按照Icm2/株接种菌块；该方法的参考文献:赵芳，赵正雄，徐发华，段凤云，吕芬，朱凯，王德勋，杨焕文，徐信养.施氮量对烟株接种黑胫病前、后体内生理物质及黑胫病发生的影响，植物营养与肥料学报，2011，17(3):737-743)，持续观察植株的生长情况。接种5天后的照片见图5A。野生型植株的地上部明显萎蔫，多数植株死亡，存活植株全株变黑或枯萎。多数转基因烟草植株地上部未见倒伏，叶片基本生长正常，仅有少数植株出现萎蔫症状。接种9天后，野生型植株已严重感病，从根部到植株地上部均发生腐化，病害延伸至叶肉组织后，叶片疏导组织已明显变黑，根部瓦解，全株坏死呈现黑色，被病原体菌丝侵染而完全腐烂。接种9天后，转基因植株的叶片尚未出现感病症状，植株地上部生长良好，在根部有轻微感病症状，出现少量坏死区域，但坏死区域未能扩散到茎部，根部完整，在植株的整个生育期内能够维持健康长`势。野生型植株和转空载体植株的生长状态没有显著差异。植株的叶片和根的放大图见图6。接种9天后的存活率统计见图5B。野生型植株的存活率仅为3%，转基因株系植株的存活率均大于70%。野生型植株和转空载体植株的生长状态没有显著差异。结果表明，转基因植株对烟草黑胫病菌的抗侵染能力显著优于野生型植株。上述结果表明，转基因植株能够抵御烟草黑胫病菌侵害，植株可以在含有病原体菌丝的土壤中生长，在植株的整个生育期内能够维持健康长势。六、转基因植株抗病相关基因的转录水平分析。取三个转基因株系的T2代植株进行抗病标志基因的转录表达RT-PCR检测，结果如图7所示。相比野生型植株，转基因植株中的PRlb基因、PR4基因、ACO基因的转录水平都有升高，且各株系中PRlb基因、PR4基因、ACO基因的转录水平与GhMLPl基因转录水平呈明显正相关。上述结果表明，过表达GhMLPl基因的烟草中，PRlb基因、PR4基因、ACO基因等相关抗病基因的转录强度大幅度升高，可能是转基因烟草较野生型的抗真菌病害能力显著增加的原因之一。
权利要求
1.GhMLPl蛋白在调控植物抗病性中的应用；所述GhMLPl蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.GhMLPl蛋白的编码基因在培育抗病植物中的应用；所述GhMLPl蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述GhMLPl蛋白的编码基因为如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子 (1)序列表中序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的DNA分子； (2)序列表中序列2自5’末端第57至530位核苷酸所示的DNA分子； (3)序列表中序列2所示的DNA分子； (4)在严格条件下与(I)或(2)或(3)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子； (5)与(I)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子。
4.如权利要求I至3中任一所述的应用，其特征在于所述抗病为抗真菌病害；所述真菌具体为大丽轮枝菌或黑胫病菌。
5.如权利要求I至4中任一所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草。
6.一种培育转基因植物的方法，是将GhMLPl蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物；所述GhMLPl蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列I衍生的蛋白质。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述GhMLPl蛋白的编码基因为如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子 (1)序列表中序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的DNA分子； (2)序列表中序列2自5’末端第57至530位核苷酸所示的DNA分子； (3)序列表中序列2所示的DNA分子； (4)在严格条件下与(I)或(2)或(3)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子； (5)与(I)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述GhMLPl蛋白的编码基因通过重组载体导入所述目的植物中；所述重组载体具体为将所述GhMLPl蛋白的编码基因插入载体pPZP-GFP的多克隆位点得到的重组质粒。
9.如权利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于所述抗病为抗真菌病害；所述真菌具体为大丽轮枝菌或黑胫病菌。
10.如权利要求6至9中任一所述的方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草。
全文摘要
本发明公开了一种获得抗真菌病害植物的方法。本发明提供了GhMLP1蛋白在调控植物抗病性中的应用；所述GhMLP1蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将GhMLP1蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物。本发明对于培育抗病植物，特别是抗真菌病害的植物具有重大价值。
文档编号C12N15/84GK103254299SQ201210041450
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者夏桂先, 杨淳淋, 王付欣 申请人:中国科学院微生物研究所