专利名称：白血病诊疗的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子医学领域，特别涉及用于白血病诊疗的基因芯片。
背景技术：
白血病的发病率逐年上升，已成为危害青少年健康的头号杀手，对儿童白血病的治疗目标已不再是简单的追求缓解率，而要通过完善的实验室检查结果和预后评估体系，根据危险因素对患儿进行分组，使每个患儿都能得到适当强度的个体化治疗，提高其远期生活质量。近20年来，以形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学(MICM)和危险因素为基础进行分型的规范化治疗及中枢神经系统白血病的预防已成为儿童白血病治疗成功的关键。尽量降低低危患儿化疗不良反应和远期并发症，同时对高危患 儿实施适度或强有力的化疗方案，对病人进行明确的亚型分类将有助于制定合适的治疗方案并预测其治疗效果，判断预后。准确评估肿瘤的细胞基因学和早期化疗反应是确保高危因素患儿不会错误地进入低危方案的关键。研究者们发现，即使是同一类型、同一治疗方案、甚至是同一剂量强度的治疗，不同的白血病患ノL会表现出不同的疗效和药物毒副反应。如果所有的儿童白血病患者都能进行免疫学、染色体及基因学方面的检查，使所有患儿都能得到严格规范的诊断，危险度都能得到准确的评价，从而使患儿得到适度的规范化化疗，将大大提高长期存活率，降低化疗远期不良反应及治疗费用。因此，对白血病患儿的早期准确诊断、危险因素与预后评估对其实施个体化治疗尤为重要。另ー方面，越来越突出的问题在于不同患者对同一化疗的反应性不一，究其根本原因，是因为患者体内存在不同基因及基因的多态性，因此，对每个患儿的个体化治疗需要对其治疗反应相关的基因进行确定。但由于目前对患者分型、判断预后等所使用的细胞形态检测、流式细胞术、巢式RT-PCR、常规染色体显带技术等方法繁多，所需的实验条件和对技术人员培训的要求高，检测费用昂贵，限制了 MICM分型与诊断在基层医院的大規模开展，使得我国基层医院住院的大部分白血病患儿仍然限于进行形态学检测为主，不能完全而准确地对患儿进行早期诊断、危险评估和个体化治疗，总体控制水平较低。因此，迫切需要ー种结果准确、简单快速、费用较低、适宜于大規模推广的实验室检测方法来将众多白血病诊断方法统一与替代。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种基因芯片，该基因芯片仅集合了少量的寡核苷酸探针就实现了多指标，其准确性高。上述芯片主要分为基因表达类检测单元、基因多态性(SNP)检测单元和染色体拷贝数(CNV)检测单元，其中基因表达类检测单元包含融合基因寡核苷酸探针18种和表达基因寡核苷酸探针48种；SNP单元包含基因SNP 47种探针；CNV检测单元包含24种探针。本试剂盒基因表达类检测单元的融合基因寡核苷酸探针能特异性检测融合基因为白血病诊断、分型、临床治疗和预后判断提供重要依据，同时也是白血病微小残留病的检测基础，检测对象包括包括 BCR/ABL a2b3、BCR/ABL a2el、BCR/ABL a2b2、TEL/ABL、TEL/PDGFR, E2A/PBX1、ETV6-RUNX1、TEL-AMLU CBFP -MYHlI、MLL-AFX, MLL-AFlp, MLL-AFlO,MLL-AF4、MLL-AF9、AML-ETO, PML/RARa、NPM/RAR 和 SET/CAN 中的任一中或多种。本试剂盒基因表达类检测单元的表达基因寡核苷酸探针能特异性检测MDR1、MRPl、LRP、GST- π、NPMl、c_myb、HOXlI、EVII、FLT3、H0XA9、H0XA10, GATAl、GATA2、MYC,Notch I、CEBPA、CD19、CD79a、CD3、CD7、CD2、CD5、CD8、CDla、CD4、CD20、CD23、CD64、CD34、CD13、CD33、CD38、CD56、CD117、CD41、CD61、GPA、T-I、T-II、T-III、T-IV、MP0、Ta / β ,Ty/δ、IgH、TCR δ , TCR y或IgG中的任ー种或多种；本试剂盒的基因多态性(SNP)检测单元中，含有突变或缺失基因的寡核苷酸探针，能特异性的检测以下基因Nras、P53、BRAF, SHIP、NPMU JAK2、FLT3、MGMT, Kras、WTUCDKN2A、RBI、TET2、PTEN、TPMT, MTHFR、CYP, TERT, MDRl。
本试剂盒的染色体拷贝数(CNV)检测单元中，能检测染色体拷贝数的变化，能检测全部染色体的拷贝数改变。为实现上述目的，本发明的技术方案为I、基因芯片，所述基因芯片含有如SEQ ID NO :1-18中任一项或多项所示的融合基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :19-66中任一项或多项所示的表达基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :67-72中任一项或多项所示的Nras突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQID NO :73-78任一项或多项所示的P53突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :79所示的Braf突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQID NO 80所示的SHIP突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO 81所示的NPMl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO ，82-83中任一项或多项所示的JAK2突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :84-85任ー项或多项所示的MGMT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :,86-88中任一项或多项所示的FLT3突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :89-92中任一项或多项所示的Kras突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO 93-95中任一项或多项所示的WTl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID N0:96所示的⑶KN2A96突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO ，97-99中任一项或多项所示的RBl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :100所示的TET2突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :101所示的PTEN突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO =102-103中任一项或多项所示的TPMT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :104所示的MHTFR突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO =105-109中任一项或多项所示的CYP突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO =110-112中任ー项或多项所示的TERT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :113所示的MKRl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO =114-137所示的染色体CNV探针。2、根据I所述的基因芯片，所述基因芯片含有如SEQ ID NO : 1_18所示的融合基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :19-66所示的表达基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO :67-72所示的Nras突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :73-78所示的P53突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO 79所示的Braf突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQID NO :80所示的SHIP突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :81所示的NPMl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO:，82-83所示的JAK2突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :84-85所示的MGMT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO:，86-88所示的FLT3突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO ,89-92所示的Kras突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :，93-95所示的WTl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO:，96所示的⑶KN2A96突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :,97-99所示的RBl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :100所示的TET2突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO :101所示的PTEN突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO : 102-103所示的TPMT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :104所示的MHTFR突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQID NO :105-109所示的CYP突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :110-112所示的TERT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :113所示的MKRl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO =114-137所示的染色体CNV探针。本发明的目的之ニ在于提供上述基因芯片的运用，该运用能为白血病患者提供全面的诊疗。
为实现上述目的，本发明的技术方案为3、1所述的基因芯片在制备白血病诊疗试剂盒中的运用。4、进一歩，，所述基因芯片在制备白血病免疫学细胞表面分子标志诊疗试剂盒中的运用；5、进ー步，所述基因芯片在制备白血病遗传学标志诊疗试剂盒中的运用；6、进ー步，所述基因芯片在制备白血病化疗药物代谢诊疗试剂盒中的运用；7、进ー步，所述基因芯片在制备残留白血病诊疗试剂盒中的运用；8、进ー步，所述基因芯片在制备肿瘤耐药多分子标志诊疗试剂盒中的运用。本发明的有益效果在于本芯片解决了我国血液系统肿瘤诊疗过程中的实际需求，通过筛选白血病免疫学、细胞遗传学和分子生物学检测指标中的关键指标来定制的基因芯片，其集合白血病的早期诊断、预警、预防、诊治的多功能基因芯片，提高白血病个体化的诊断率和疗效，缩短住院时间，降低医疗费用，提高基层医疗卫生机构技术水平。
具体实施例方式下面将结合具体实施例，进ー步阐述发明。应当理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不限于本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I基因芯片的制备一、探针设计与合成本上述芯片主要分为基因表达类检测单元和基因多态性(SNP)检测单元，其中基因表达类检测单元包含融合基因寡核苷酸探针18种和表达基因寡核苷酸探针48种；SNP单元包含基因SNP 47种探针。本试剂盒基因表达类检测单元的融合基因寡核苷酸探针能特异性检测融合基因为白血病诊断、分型、临床治疗和预后判断提供重要依据，同时也是白血病微小残留病的检测基础，检测对象包括包括 BCR/ABL a2b3、BCR/ABL a2el、BCR/ABLa 2b2、TEL/ABL、TEL/PDGFR、E2A/PBX1、ETV6-RUNX1、TEL-AMLU CBF^ -MYHlU MLL-AFX, MLL-AFIp, MLL-AFl0,MLL-AF4、MLL-AF9、AML-ETO、PML/RARa、NPM/RAR 和 SET/CAN 中的任一中或多种。本试剂盒基因表达类检测单元的表达基因寡核苷酸探针能特异性检测MDR1、MRPl、LRP、GST- π、NPMl、c_myb、HOXlI、EVII、FLT3、H0XA9、H0XA10, GATAl、GATA2、MYC,Notch I、CEBPA、CD19、CD79a、CD3、CD7、CD2、CD5、CD8、CDla、CD4、CD20、CD23、CD64、CD34、CD13、CD33、CD38、CD56、CD117、CD41、CD61、GPA、T-I、T-II、T-III、T-IV、MP0、Ta / β ,Ty/δ、IgH、TCR δ , TCR y或IgG中的任ー种或多种；本试剂盒的基因多态性(SNP)检测单元中，含有突变或缺失基因的寡核苷酸探针，能特异性的检测以下基因Nras、P53、BRAF, SHIP、NPMU JAK2、FLT3、MGMT, Kras、WTUCDKN2A、RBI、TET2、PTEN、TPMT, MTHFR、CYP, TERT, MDRl。本试剂盒的染色体拷贝数(CNV)检测单元中，能检测染色体拷贝数的变化，能检测全部染色体的拷贝数改变。在Genebank里找到上述如SEQ IN. NO :1_1 37所示的基因序列，利用软件进行探针设计，标记，合成，验证合格后，溶解，稀释，备用。ニ、芯片点阵方法将所有基因的寡核苷酸探针用探针缓冲液稀释至ΙΟΟμπιοΙ/L，置384孔板中点样，以序列的互补链作为阳性对照探针，以同等浓度无关探针(与靶序列无同源性的鱼的寡核苷酸序列)作为阴性对照，用PixSys5500自动芯片制作机(Catesian Technologies,Inc，美国)在相対湿度为62 %的条件下将DNA样品探针点样在25mm X 75mm硅化玻片表面，样品点之间的距离为250nm，所有探针排列成ー个16行7列的矩阵，每个基因有3个基因阵列重复。在60°C水浴箱中对DNA芯片进行重新水合化20s，在80°C加温板上干燥5s，在65mJ 下用紫外交联仪 Stratalinkerl 800 (Stratagene, LaJolla,美国)对 DNA 探针进行紫外交联固定。之后进行封闭处理，封闭液的组成为4. 28g琥珀酸酐溶于239. 3mLト乙基-2-吡咯烷酮中，随后加入10. 7mL硼酸钠(pH8. O)。将载有DNA微阵列的玻片浸入95°C热水中对DNA进行2min变性处理，在95%的酒精溶液中浸洗5次，室温下空气干燥，在室温及黑暗条件下储存备用。实施例2芯片性能检测一、基因芯片杂交为测定特异性的杂交实验进行2次重复，而其他芯片杂交实验进行3次重复。15μ1的标准杂交液含有3Χ柠檬酸钠缓冲溶液(SSC)，lyg未标记的青鱼卵DNA (Promega，Madison，USA)、0· 3%十二烷基硫酸钠(SDS)以及目的PCR产物5 μ I。用于测试灵敏度和检测目的基因的杂交液体积为2 μ I，其所含成分的浓度同前。杂交液直接加在固定好的DNA阵列所在的准确位置，然后再盖上盖玻片。荧光素标记的DNA用杂交液稀释后在100°C下变性2min，冷却至环境温度，先加到盖玻片上，然后以DNA阵列面朝下放到盖玻片上。将芯片翻转后置放到防水的杂交盒，在杂交盒两端的水孔中各加入15 μ I 3X SSC以保持湿度，将杂交盒加盖密封后放人水浴箱进行杂交处理。杂交在45 V或者65 °C下进行12 15h。杂交后芯片分别在室温下1XSSC+0. 2% SDS和0. 1XSSC+0. 2% SDS洗涤液中洗涤5min，在0. IXSSC中洗涤30s。接着将芯片置于黑暗中，在空气中干燥。ニ、芯片扫描和杂交信号的定量分析杂交芯片用激光共聚焦芯片扫描仪系统(ScanArray⑩5000)进行扫描，首先在分辨率50 μ m下进行初步扫描以得到ー个快速显示的图像，然后对目标图像在分辨率为5 μ m下进行精确扫描。激发光源为绿色HeNe或HeNe激光(分别用荧光素Cy3或cy5)，荧光素所发射的荧光由光电倍增管在570nm(Cy3)或670nm(Cy5)进行探測。对于灵敏度实验和样品的检测激光強度和光电倍增率均为100%。对于其他芯片杂交实验激光強度均为95%，光电倍增率均为90%。扫描获得的图像被储存为16位TIFF文件，然后用计算机软件ImaGene 3. O版对每ー个杂交点的光素密度(或強度)进行定量分析。一个用来定义阵列中每ー个DNA斑点圆圈的方格叠加在图像上，用以确定每ー个需要定量的荧光斑点。分析获得每一斑点的平均信号強度，数据文件输出到Excel软件和专用软件进ー步分析。局部背景信号被自动地从每ー単独的斑点杂交信号中减去。每ー个杂交信号的最后定量值中减去5个阴性対照的平均荧光强度值。用计算机软件SPSS进行统计分析。
实施例3芯片的应用本基因芯片同其他含基因寡核苷酸探针的基因芯片的检测流程相同。对188例白血病，其中35例急性髓细胞白血病(AML)、153例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者标本进行检测，提取样本总RNA，接着将RNA反转录为cDNA，利用本芯片检测结果
分析，详见下表。
白血病芯片预实验检测结果与探针序列 基因分类—^基因名称AML(35例)丨—~ALL(153例)jHf序列
融合基因卩日tt例 1 卩日14例!数！
—BCR/ABL _~_8__6__
——BCR/ABL a2b34SEQ ID.NO:l
——BCR/ABL a2el2 2SEQ ID.NO:2
——BCR/ABL a2b22 4SEQ ID.NO:3
TEL/ABL_ 4____SEQ iD.NO:4
TEL/PDGFR—SEO ID.NO:5
E2A/PBX116SEO ID.NO:6
ETV6-RUNX18SEO ID.NO:7
TEL-AMLl11SEQ ID.NO:8
CBFg-MYHll3SEQ ID.NO:9
MLL-AFX7SEQ ID.NOrlO
MLL-AFId4SEQ ID.NO:ll
MLL-AFlO3SEQ ID.NO:12
MLL-AF46SEQ ID.NO:13 :
MLL-AF94SEQ ID.NO]4 ~
. AML-ETO4SEQ ID.NO:15 —
PML/RARa9SEQ ID.NO:16
NPM/RAR3SEQ ID.NO:17
SET/CANI ISEQ ID.NO:18 —
表达基因 f_I_[_[_
权利要求
1.基因芯片，其特征在于所述基因芯片含有如SEQID NO :1-18中任一项或多项所示的融合基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :19-66中任一项或多项所示的表达基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO 67-72中任一项或多项所示的Nras突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :73-78任一项或多项所示的P53突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO 79所示的Braf突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQID NO 80所示的SHIP突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :81所示的NPMl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO:82-83中任一项或多项所示的JAK2突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO :84-85任ー项或多项所示的MGMT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :86-88中任一项或多项所示的FLT3突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :89-92中任一项或多项所示的Kras突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO 93-95中任一项或多项所示的WTl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO ，96所示的⑶KN2A96突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO :97-99中任一项或多项所示的RBl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :100所示的TET2突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO :101所示的PTEN突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO =102-103中任一项或多项所示的TPMT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :104所示的MHTFR突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO : 105-109中任一项或多项所示的CYP突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO =110-112中任ー项或多项所示的TERT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :113所示的MKRl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :114-137所示的染色体CNV探针。
2.根据权利要求I所述的基因芯片，其特征在于所述基因芯片含有如SEQID NO:1-18所示的融合基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :19-66所示的表达基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :67-72所示的Nras突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO 73-78所示的P53突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :79所示的Braf突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO 80所示的SHIP突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO 81所示的NPMl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :82-83所示的JAK2突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :84-85所示的MGMT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ IDNO 86-88所示的FLT3突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :89-92所示的Kras突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO ，93-95所示的WTl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQID NO ,96所示的CDKN2A96突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :97-99所示的RBl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :100所示的TET2突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :101所示的PTEN突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO : 102-103所示的TPMT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :104所示的MHTFR突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :105-109所示的CYP突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO =110-112所示的TERT突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :113所示的MKRl突变基因寡核苷酸探针，含有如SEQ ID NO :114-137所示的染色体CNV探针。
3.权利要求I所述的基因芯片在制备白血病诊疗试剂盒中的运用。
4.根据权利要求3所述的运用，其特征在于所述基因芯片在制备白血病免疫学细胞表面分子标志诊疗试剂盒中的运用。
5.根据权利要求3所述的运用，其特征在于所述基因芯片在制备白血病遗传学标志诊疗试剂盒中的运用。
6.根据权利要求3所述的运用，其特征在于所述基因芯片在制备白血病化疗药物代谢诊疗试剂盒中的运用。
7.根据权利要求3所述的运用，其特征在于所述基因芯片在制备残留白血病诊疗试剂盒中的运用。
8.根据权利要求3所述的运用，其特征在于所述基因芯片在制备肿瘤耐药多分子标志诊疗试剂盒中的运用。
全文摘要
本发明涉及分子医学领域，特别涉及用于白血病诊疗的基因芯片，所述芯片含有如SEQ ID NO1-137中所述序列的寡核苷酸探针，本芯片解决了我国血液系统肿瘤诊疗过程中的实际需求，通过筛选白血病形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学检测指标中的关键指标来定制基因芯片，是集合白血病的早期诊断、预警、预防、诊治的多功能基因芯片，可以提高白血病个体化的诊断效率和疗效，缩短住院时间，降低医疗费用，提高基层医疗卫生机构技术水平。
文档编号C12Q1/68GK102676648SQ20121004761
公开日2012年9月19日 申请日期2012年2月29日 优先权日2011年3月7日
发明者张鹏辉, 谭俊杰, 邹琳 申请人:重庆医科大学附属儿童医院