专利名称：一种检测胶质母细胞瘤Id1 mRNA表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种试剂盒，具体来说是一种检测胶质母细胞瘤Idl mRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
胶质瘤是起源于胶质细胞的肿瘤，是人类中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，约占颅内肿瘤的35. 26%—60. 96%。WHO于2008年公布按死亡率顺序排位，恶性胶质瘤是34 岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35 54岁患者的第3位死亡原因。在全球，每年恶性脑胶质瘤无情地夺去18 60万中青年人的宝贵生命。目前治疗胶质母细胞瘤的标准方法是外科切除后再辅以放射治疗和口服化疗药。但是对于GBM患者，其总体生存期为14.6 个月，而无进展生存期只有7. 9个月。肿瘤组织中基因的检测有利于进一步从分子机制上对胶质瘤进行分型、诊断及预后判断。因此，胶质母细胞瘤患者中基因水平是其进行认识胶质瘤发生发展机制的一个重要指标。肿瘤组织中特异性基因mRNA的定量测定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的Taqman荧光探针为寡核昔酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’ -3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条工作曲线，根据该曲线可对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术是一种能够准确定量mRNA的检测方法，通过检测肿瘤特异性基因mRNA的表达以判断循环肿瘤细胞的存在。Idl (DNA结合抑制蛋白)蛋白属于helix-loop-helix (HLH)蛋白家族。Idl蛋白通过形成无活性的异二聚体，从而阻止bHLH家族转入因子介导的细胞分化。并且阻止DNA在E boxes (CANNTG) ,N boxes (CACNAG)，或Ets (GGAA/T)等位点与bHLH蛋白结合，从而调节基因的转录。Idl蛋白在功能上慢参与调节细胞间信号传导、细胞生长、分化、凋亡与血管生成。 一般的，Idl的mRNA的高表达出现在分化不全或者是胚胎细胞组织内。Idl蛋白在恶性肿瘤的的发生中起着潜在的“扳机”样作用，并且是一个潜在的癌基因。Idl在肿瘤中的作用是参与肿瘤细胞的分化、增生、调节细胞周期、促血管生成及参与肿瘤细胞的侵袭和迁移。当Idl 基因的调节失衡，就会促使肿瘤的发生。(8J. D. Norton, ID helix-loop-helix proteins in cell growth, differentiation and tumorigenesis, J.Cell Sci. 113 (2000), pp. 3897-3905. View Record in Scopus | Cited By in Scopus (329)。)Idl 在 GBM 中的蛋白表达是升高的，GBM患者的Idl mRNA表达亦明显上调。K-M总体生存分析发现Idl基因
3的拷贝数(copy number)值越高，GBM患者的预后越差。Idl的mRNA表达越高，预后越差。 cox回归分析发现，Idl的表达越高，死亡危险度升高(p < 0. 05)。而无进展生存期(PFS) 相关分析发现，Idl与肿瘤的复发成正相关。故Idl在胶质母细胞瘤中起到一个恶性相关的因子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测人胶质母细胞瘤Idl mRNA表达量的试剂盒，要解决现有技术中没有合适的手段检测检测人胶质母细胞瘤Idl mRNA表达量的技术问题。本发明一种检测人胶质母细胞瘤Idl mRNA表达量的试剂盒，包括两个引物和探针，一个引物的序列如SEQ ID NO :1所示，另外一个引物的序列如SEQ IDNO :2所示，所述的探针的序列如SEQ ID NO 3所示。进一步的，所述试剂盒中还包括进行实时荧光定量RT-PCR所需的试剂。本发明还提供了上述的试剂盒在检测人胶质母细胞瘤DNA结合抑制蛋白Idl mRNA表达量中的应用。发明人通过研究发现胶质母细胞瘤中的Idl mRNA的表达量与诊断及预后相关。 在Idl表达高的病例组中，胶质母细胞瘤患者的生存时间是缩短的，而在Idl表达较低一组中，患者的生存时间较前者是延长的。因此，胶质母细胞瘤组织中Idl的mRNA水平可以作为对于患者生存时间预测的一个生化指标。本发明所提供的试剂盒可准确定量待测标本中人胶质母细胞瘤DNA结合抑制蛋白mRNA表达量。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中，可对胶质母细胞瘤组织中 Idl mRNA的表达情况进行定性及定量分析，对判断胶质母细胞瘤患者治疗效果及动态观察病情具有重要意义，本发明将在医学检测领域发挥重要作用。
图I为标准品的检测结果。图2为标准品的标准曲线。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I 一种检测胶质母细胞瘤组织样本的Idl mRNA表达量的试剂盒的制备试剂盒中各组分为(一)细胞裂解液I ; (二)细胞裂解液II ;(三)RNA洗涤缓冲液I ;(四)RNA洗涤缓冲液II ;(五)无RNA酶的水；(六)RNA分离柱；(七)收集管； (八)PCR管；(九)DNA酶I储存液；(十)反转录缓冲液；(i^一 ) dNTP混合物；(十二)逆转录酶储存液；(十三)PCR反应液和探针；(十四)尿嘧啶DNA糖基化酶((UNG酶)储存液；(十五)标准品；(十六)对照品(包括阳性对照品和阴性对照品)。上述各组分的组成或制备如下(一)细胞裂解液I溶质是如下终浓度的物质0. lmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、0. lmol/L氯化钠和O. 05mol/L氯化镁，溶剂是水。细胞裂解液I在25°C条件下，pH值为7. 6。(二)细胞裂解液II溶质是如下终浓度的物质3mol/L异硫氰酸肌、2mol/L盐酸肌、O. 3mol/L醋酸钠、 O. 2%十二烷基硫酸钠，溶剂是水。细胞裂解液II在25°C条件下，pH值为5. 2。(三)RNA洗涤缓冲液I溶质是如下终浓度的物质0. 2mol/L醋酸钠、O. lmol/L氯酸钠、O. lmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，溶剂是水。RNA洗涤缓冲液I在25°C条件下，pH值为7.6。(四)RNA洗涤缓冲液11溶质是如下终浓度的物质1. 2mol/L柠檬酸钠、O. 5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，溶剂是水。RNA洗涤缓冲液II在25°C条件下，pH值为7. 5.(五)无RNA酶的水向去离子水中加入焦碳酸二乙酯(DEPC)(购自Biobasic公司)，至终浓度为 O. 05%，22-25°C放置10-12小时后，121 °C高压灭菌20分钟，22_25°C放置备用。(六)RNA分离柱购于安徽优晶生物工程有限公司。(七)收集管购于安徽优晶生物工程有限公司。(八)PCR管购于美国Applied Biosystems (ABI)公司。(九)DNA酶I储存液溶质是如下终浓度的物质50mmol/L三轻甲基氨基甲烧-盐酸、25mmol/L三轻甲基氨基甲烷一乙酞、12. 5mmol/L氯化镁、5. 5mmol/L氯化钙、25%甘油、O. 5U/ul DNA酶I。溶剂是水。DNA酶I储存液在25 °C条件下，pH值为7. 5。(十)反转录缓冲液溶质是如下终浓度的物质9.lumol/L Oligo (dT) 12_8(TaKaRa)、3. 6U/ulRNA 酶抑制剂、72. 7mmol/L 二硫苏糖醇(Invitrogen)、182mmol/L三轻甲基氨基甲烧-盐酸、 273mmol/L氯化钾、llmmol/L氯化镁，溶剂是水。反转录缓冲液在25°C条件下，pH值为8. 3。( ^^一 ) dNTP 混合物含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐一水溶液，25°C条件下，pH值为7. 0-7. 5，四种 dNTP浓度终浓度均为10mmol/L。如dATP为脱氧腺苷三磷酸，磷酸上的三个氢中的一个或两个被钠所取代，便形成了钠盐。其他几种也是如此，即dNTP是以钠盐形式存在的。(十二)逆转录酶储存液溶质是如下终浓度的物质20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钠、0. lmmol/L 乙二胺四乙酸、I. 0mmol/L 二硫苏糖醇(Invitrogen)、50 % 甘油、0. 01 % Nonidet p_40, 200U/ul逆转录酶(Invitrogen),溶剂是水。逆转录酶在25°C条件下,pH值为 7. 5。(十三)PCR反应液和探针I，PCR 反应液
溶质是如下终浓度的物质18. 5mmol/L三轻甲基氨基甲烧-盐酸、2. 78mmol/L氯化镁、92. 6mmol/L 氯化钾、O. 37a mol/L 上下游引物、O. lU/ulTaq 酶(TaKaRa)、400nmol/L dATP,400nmol/L dCTP, 400nmol/L dGTP, 400nmol/L dTTP，溶剂是水。PCR反应液在25 °C条件下，pH值为8. 3。上述引物为Pl (上游引物)5，-gacatgaacggctgttactc-3' (SEQ ID NO 1),P2(下游引物)5，-ggttccaacttcggattc-3' (SEQ ID NO :2)。引物可溶于TE溶液中(TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸， lmmol/L乙二胺四乙酸,水)。2、探针探针序列为5，-FAM-accttcagttggagctgaactc-TAMRA-3'(SEQ ID NO:3)。探针可溶于TE溶液中(TE溶液的组成为lOmmol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸， lmmol/L乙二胺四乙酸，水)，探针的浓度为2u mol/L。上述引物和探针是以Idl全长cDNA序列为模板，使用AB工7000型实时荧光定量 PCR仪随机软件分析TaqMan引物和探针位点，同时考虑Idl基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合得到的。上述引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。(十四)尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)储存液溶质是如下终浓度的物质50%甘油、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、 150mmol/L氯化钠、I. 0mmol/L 乙二胺四乙酸、I. 0mmol/L二硫苏糖醇(Invitrogen),0. 05% Tween20, lU/ul尿嘧啶DNA糖基化酶，溶剂是水。UNG酶储存液在25°C条件下，pH值为7. 5.(十五)标准品标准品为终浓度为2X108拷贝数/I. I的pMD 18_Idll21重组质粒，TE溶液溶解 (TE溶液的组成为lOmmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，lmmol/L乙二胺四乙酸，水)。标准品中插入的Idl片段的DNA序列如序列表中SEQ ID NO 4所示。I、细胞总RNA的提取I)将人脑胶质母细胞瘤u87细胞，用DMEM完全培养基(Gibe。公司)按常规方法进行培养。2)将培养的细胞用0. 25%胰蛋白酶(质量百分含量)消化，IOOOrpm离心收集细胞，转移到I. 5mL离心管中，每管约1X106个细胞。3)提取细胞总RNA，具体过程如下①往沉淀的细胞中加入650ul细胞裂解液II (向细胞裂解液II中加入2_巯基乙醇，加入量为每ImL细胞裂解液II加入20ul浓度为14. 5mol/L的2-巯基乙醇，分装2-巯基乙醇要在通风橱下进行)，漩涡振荡充分混匀。②再加入650ul的70%乙醇，漩涡振荡混匀。③把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分离柱内， IOOOg离心I分钟，弃去流出液体并继续进行步骤③的操作。④向DNA酶I储存液管中加入400ul无RNA酶的水，混匀、短暂离心收集，吸取45ul 该液体直接加到RNA分离柱滤膜上，室温放置15分钟。⑤吸取700ul RNA洗涤缓冲液I加入到RNA分离柱上洗涤柱子，IOOOOg离心I分钟，弃去2mL收集管。⑥将RNA分离柱固定于另一新的2mL收集管上，加入500ul经稀释的RNA洗涤缓冲液II (RNA洗涤缓冲液II在使用前，每3mL加入12mL无水乙醇)，IOOOOg离心I分钟，弃
去流出液，该收集管可重复使用。⑦再用500ul的RNA洗涤缓冲液II洗涤柱子，离心并弃去流出液。然后12000g 离心I分钟，甩干RNA分离柱基质。⑧把柱子转移到无RNA酶的I. 5ml离心管，加入50ul无RNA酶的水，确保加入的无RNA酶的水直接加在柱基质上，IOOOg离心I分钟，洗脱RNA。将装有RNA溶液的离心管置于冰盒上，备用。2、逆转录反应将dNTP混合物及逆转录酶储存液加入反转录缓冲液中配制成反转录反应液 (dNTP混合物、逆转录酶储存液、反转录缓冲液的体积比为2 I 11)，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余的反转录反应液可于20°C冰箱中保存。反转录体系为反转录反应液3. 5ul、总RNA溶液4. Oul、无RNA酶的水2. 5ul。反转录反应条件为4201，15分钟，951，5分钟。反应结束后,取出离心管置于冰盒上。3，PCR 扩增用TaKaRa公司的普通PCR扩增试剂盒，参照试剂盒说明书进行操作。PCR反应体系为反转录产物5ul，IOXPCR缓冲液5. Oul，dNTP混合物4. Oul，上、下游引物(P1,P2)各 2. Oul，Taq 酶 O. 5ul、水 31.5ul。PCR反应条件为先94°C、3分钟再94°C、30秒，60°C，45秒，72°C、50秒，共35个循环，最后72 °C、7分钟。4，Idl扩增产物的获得I)将PCR扩增产物进行I. 2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取含121bp目的DNA 片段的琼脂糖凝胶，用纸巾擦千后，切碎，称重，按照IOOmg = IOOul的比例确定胶的体积。2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自上海英俊生物技术有限公司)回收扩增产物①按照试剂盒说明书中的比例在回收胶中加入DE-A液，60°C加热至完全熔化。②加入O. 5倍体积于DE-A液的DE-B液，混匀；加入异丙醇，使其终浓度为20%。③将上述液体转入制备管中，5500rpm离心I分钟,弃滤液。④加入O. 5mL缓冲液Wl后，5500rpm离心I分钟,弃滤液。⑤加入O. 7mL缓冲液W2, 5500rpm离心I分钟,弃滤液。⑥再加入O. 7mL缓冲液W2, 5500rpm离心I分钟，弃滤液;12000rpm,离心I分钟，
以甩千滤膜基质。⑦将制备管置于新的I. 5mL离心管中，在滤膜中央加入25ul水，室温静置I分钟后，12000rpm,离心I分钟洗脱DNA。5，Idl的克隆及鉴定I)重组载体的构建①IOul 体系中，加入 Iul T 载体(pMD18-T Vector) (TaKaRa)，4ulDNA 样品，加入 5u I连接缓冲液(100mmol/L三轻甲基氨基甲烧-盐酸、15mmol/L氯化镁、I. Ommol/L三磷酸腺苷、20mmol/L 二硫苏糖醇(Invitrogen)、lU/ulDNA连接酶。连接缓冲液在25°C条件下， pH值为7.5.), 16°C反应14小时。②取5ul连接产物，加入到IOOul大肠杆菌DH5a感受态细菌中，混匀后冰浴40 分钟，置于42°C水中热休克90秒，冰浴2分钟。③加入无抗生素的LB培养基400ul,于37°C摇床上以150rpm的速度混合振摇45 分钟后，将离心管中液体均匀地涂布于LA平板上，37°C平放20分钟后，倒置培养12小时。2)重组载体的鉴定①观察LA平板上的菌落，随机挑取长得较好的菌落，分别转至装有5mLLA培养基的大试管中，编号后置37°C摇床中，250rpm，振摇8-14小时左右，至OD6tltl ^ O. 4。②取I. 5mL培养物至离心管中，4°C，IlOOOrpm离心30秒，弃尽上清液。③IOOul 预冷的裂解液 I (500mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris. Cl (ρΗ8· O, 25。。)， 10mmol/LEDTA(pH8. O, 25 °C )，水)重悬沉淀，剧烈振荡混匀后加入200ul新配制的裂解液II (200mmol/l NaOH, I % SDS,水)，混匀后，冰浴3分钟，再加入150ul预冷的裂解液 III (3mol/L醋酸钾；pH5. 2，25°C )，颠倒混匀后冰浴3-5分钟；4°C，IlOOOrpm离心5分钟后将上清转移至另一离心管中。④加入等体积的酚/氯仿(I 1)，振荡后V C，IlOOOrpm离心2分钟，再将上清
转移至另一离心管。⑤加入1/10体积的3M NaAc溶液和2. 5倍无水乙醇，混匀后，室温静置10分钟， 4°C, IlOOOrpm离心10分钟后弃上清。⑥加入ImL 70%乙醇，振荡漂洗后4°C，IlOOOrpm离心2分钟；弃去上层液体。⑦加入少量无水乙醇，4°C, IlOOOrpm离心2分钟，弃去乙醇后，室温倒置10分钟， 加入30ul蒸馏水溶解质粒DNA。⑧取适量的质粒DNA作为模板，在引物Pl和P2的引导下，进行PCR鉴定，可扩增出151bp DNA片段的为阳性克隆质粒，从而筛选出目的菌落。3) Idl扩增产物的鉴定①质粒的大量抽提A)取ImL含目的菌落的菌液，加入到30mL LA培养基中，摇床培养至OD6tltl约为 O. 6。B)取25mL上述菌液接种至300mLLA培养基中，37°C，250rpm培养10-14小时，然后VC, 4500rpm, 20分钟离心收菌。C)用 200mL预冷的STE(10mmol/L Tris-HCl (PH8. O, 25°C ), O. Imol/LNaCI, lmmol/ L EDTA(PH8. 0，25°C )，水)重悬菌体，4°C，4500rpm，20 分钟离心收菌。D)加入 9mL Solution I (500mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris. Cl (pH8. 0, 25°C ), IOmmoI/L EDTA (pH8. 0，25°C )，水)，混匀，再加入 ImL 用 IOmmoI/L Tris-HCl (ρΗ8· O)新鲜配制的溶菌酶(10mg/mL),再加入 IOmL新鲜配制的 Solution II (200mmol/l NaOH, I % SDS, 水)，轻轻混匀5-7次，室温静置5分钟。E)加入 7. 5mL 冰冷的 SolutionIII (3mol/L 醋酸钾；pH5. 2，25°C )，轻轻混匀，冰浴 10分钟；4°C，IlOOOrpm离心10分钟，取上清。F)加入2/3体积的异丙醇，混匀，室温静置10分钟，IlOOOrpm离心10分钟，弃上清。G)用70%乙醇洗涤沉淀，8000rpm，15分钟离心回收，用2mL TE溶解沉淀。H)加入2mL 5mol/L的LiCl，混匀，IOOOOg离心10分钟，弃去上清。I)用70%乙醇洗涤沉淀，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。J)加入300ul TER，溶解沉淀，转移至I. 5mL离心管中，37' C水浴1-2小时。K)加入 300ul I. 6mol/L NaCl (含 13%聚乙二醇)，混匀，4°C，12000rpm 离心 15 分钟，弃上清。L)250ulTE(pH8. O)溶解沉淀，分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。M)取上清，加入60ull0mol/LNH4Ac及2倍体积的无水乙醇(或95%乙醇)，混勻，4。。，12000g离心5分钟，弃上清。N)120ul75%乙醇洗涤沉淀，4°C，12000g离心10分钟，弃上清，尽量控干液体，室
温静置至干燥。O)加入IOOul三蒸水溶解沉淀，紫外分光光度计下检测质粒的浓度和纯度。②质粒的序列测定对含有目的基因片段的阳性克隆质粒用美国Applied Biosystems公司的377测序仪进行序列测定，结果重组载体中的插入片段Idl具有序列表中SEQ ID NO 4的DNA序列，将该重组载体命名为pMD 18-Idll21。将pMD 18_Idll21作为标准品。③将上述抽提得到的质粒pMD 18-Idll21用TE溶液溶解(TE溶液的组成为 lOmmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，lmmol/L乙二胺四乙酸，水)至终浓度为2X108拷贝数
/ulo将上述各组分分装，组合为10人份的试剂盒，每盒中各组分的量为细胞裂解液 I I瓶(30mL/瓶)、细胞裂解液II I瓶(IOmL/瓶)、RNA洗涤缓冲液I I瓶(IOmL/瓶)、 RNA洗涤缓冲液II I瓶(3mL/瓶)、无RNA酶水I瓶(4mL/瓶)、RNA分离柱、收集管、PCR 管、DNA酶I储存液I管(120ul/管)、反转录缓冲液I管(33ul/管)、dNTP混合物I管 (6. Oul/管)、逆转录酶I管(3. Oul/管)，PCR反应液I管(251. 75ul/管)、UNG酶储存液 I管(4. 75ul/管)、探针I管(28. 5ul/管)、标准品I管(loul/管)实施例2、人胶质母细胞瘤DNA结合抑制蛋白基因mRNA表达量的检测用实施例I制备的10人份的试剂盒检测下述实验组和对照组标本中的人胶质母细胞瘤DNA结合抑制蛋白基因mRNA表达量。实验组6例病理诊断确诊的人胶质母细胞瘤患者一、标本检测I)取出组织，在液氮中研磨成粉末2)待液氮挥发干,立即加入Trizol,每IOOmg组织中加Iml Trizol,融化后用加样枪反复吸吹，使样品充分裂解，移入I. 5ml离心管中，室温静置3 5分钟。3)加入0. 2ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15_30°C放置2_3分钟，然后离心12，OOOXg, 15minutes, 2-8°C。离心后分成三层，下面的红色为酹_氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总TRIZOL的60%。4)RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0. 5ml异丙醇，静置 IOminutes, 15_30°C,然后离心12, OOOXg, IOminutes, 2_8°C。离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。5) RNA洗涤去上清，加入Iml 75 %乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心 7,500Xg,5minutes,2-8°C。6)RNA再溶解去上清，置真空或空气中5_10分钟，干燥RNA沉淀，(不能在真空中离心干燥)。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的 RNA 样品其 A260/280ratio <1.6。7)用无RNase水或O. 5% SDS溶液重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10 分钟，55-60 V。测浓度后-20 V保存。8)测浓度取2 μ I储存液加入另一个EP管中，再加入98 μ I无RNase水，离心混勻，以无 RNase 水作空白对照，测 0D260/280 值。IOD = 40 μ g RNA。0D260/280 值在 I. 8-2. O 视为纯度很高。一般浓在1000ng/ml较准。浓度太高要稀释以后再测定。9) RNA鉴定甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。四、荧光定量PCRI、实验组样品RNA的反转录反转录体系反转录反应液3. 5ul、总RNA溶液5. . Oul、无RNA酶的水I. 5ul。反转录反应条件为42°C、15分钟，95°C、5分钟。反应结束后，将反应产物取出置于冰盒上。得到实验组样品反转录产物。2、标准品的处理将标准品贮存液(2X108拷贝数/ul)梯度稀释为 2X107，2X106，2X105，2X104，2X103， 2X102,2X101 拷贝数/ul。3，荧光定量PCR①β -actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μ I按 10倍稀释(加水27 μ I并充分混匀)为IO10,依次稀释至109、IO8、107、IO6、105、IO4,以备用。②反应体系如下标准品反应体系序号反应物剂量I SYBR Green I 染料 10 μ I2阳性模板上游引物F O. 5 μ I3阳性模板下游引物R O. 5 μ I4 dNTP O. 5 μ I5 Taq 酶 I μ I6 6 阳性模板 DNA 5 μ I7 ddH20 32. 5 μ I8 总体积 50 μ I轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系序号反应物剂量I SYBR Green I 染料 10 μ I2内参照上游引物F O. 5μ I
3内参照下游引物R O. 5μ I4 dNTP O. 5 μ I5 Taq 酶 I μ I6 待测样品 cDNA5yl7 ddH20 32. 5 μ I8 总体积 50 μ I轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为93°C 2分钟，然后 93 0C I分钟，55°C 2分钟，共40个循环。五、标准曲线的制作标准品突光定量PCR检测结果如图I所示。横坐标为PCR反应的循环数,纵坐标为检测器检测到的荧光值，图中曲线从左至右分别代表起始模板数为1X108，1X107， IXlO6. IXlO5, IXlO4，IXlO3, IX102 拷贝数。根据检测结果绘制标准曲线，标准曲线如图2所示。横坐标为模板稀释度，纵坐标为Ct值。六、检测结果选中上述所有样品检测孔，根据标准曲线进行相应分析，得出待测样品的起始模板数((M)。每毫升样本中Idl mRNA的拷贝数N = M X 6. 6。6例临床确诊的脑腺癌患者检测结果均为阳性，具体结果如表I所示。患者编号性别年龄标本Idl mRNA值(拷贝数/毫升全血)
权利要求
1.一种检测人胶质母细胞瘤Idl mRNA表达量的试剂盒，其特征在于包括两个引物和探针，其中一个引物的序列如SEQ ID NO :1所示，另外一个引物的序列如SEQ ID NO :2所示，所述的探针的序列如SEQ ID NO 3所示。
2.如权利要求I所述的一种检测人胶质母细胞瘤IdlmRNA表达量的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括进行实时荧光定量RT-PCR所需的试剂。
3.权利要求I或2所述的一种检测人胶质母细胞瘤IdlmRNA表达量的试剂盒在检测人胶质母细胞瘤Idl mRNA表达量中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种检测人胶质母细胞瘤Id1 mRNA表达量的试剂盒，包括两个引物和探针，一个引物的序列如SEQIDNO1所示，另外一个引物序列如SEQIDNO2所示，所述的探针的序列如SEQIDNO3所示。本发明还提供了上述的试剂盒在检测人胶质母细胞瘤DNA结合抑制蛋白Id1mRNA表达量中的应用。本发明所提供的试剂盒可准确定量待测标本中人胶质母细胞瘤DNA结合抑制蛋白Id1mRNA表达量。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中，可对胶质母细胞瘤患者的外周血中Id1mRNA的表达情况进行定性及定量分析，对判断胶质母细胞瘤患者治疗效果及动态观察病情具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102586458SQ20121006779
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者兰津, 邱永明 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院