专利名称：一种油桐壳生产生物丁醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种油桐壳生产生物丁醇的方法。
背景技术：
油桐(Vernicia fordii Hemsley)属于大戟科油桐属，为中亚热带落叶乔木,是原产我国且栽培利用悠久的重要工业油料树种。在湖南、湖北、贵州、重庆、四川、广西、广东、云南、陕西、河南、安徽、江苏、浙江、江西、福建、台湾等地区均有栽培分布，其中以湖南、重庆、贵州、湖北的毗邻地区为中心产区。油桐的主要产品是桐油，为最佳干性油之一，在工业上具有广泛用途。油桐壳是油桐果加工桐油的副产物，占油桐果鲜重的40-55%。长期以来，油桐壳大多被人们丢弃浪费，被丢弃的油桐壳在降解过程中产生的异味气体污染空气，产生的液体和固体污染水源。2011年我国原油进口依存度高达55. 3%，预计到2015我国原油进口依存度将超过65.0%。对化石能源，特别是石油资源的高依赖程度正制约着我国经济的可持续发展，影响着国家的战略安全。随着石油资源的耗竭和温室效应等环境问题的日益突出，高效利用可再生原料生产能源和化学品已成为全球关注的重点之一。醇类是一类重要的平台化学品，其中大部分醇可以通过微生物发酵转化而得，因此，醇类被认为是极具发展潜力的生物燃料和生物基化学品。丁醇是一种重要的平台化学品，主要用于制造增塑剂或用作溶齐U、萃取剂等。近年来，研究人员发现丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，其含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道，不易吸水，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合。所以，丁醇已成为被世界各国企业和研究机构强烈关注的一种极具潜力的新型生物燃料[Durre, P.，Biobutanol: an attractive biofuel. Biotechnol.J. 2007，2，(12)，1525-34. ]。丁醇燃料的使用可以有效地减少化石燃料的消耗和温室气体的排放。目前，丁醇主要通过化学合成法生产，其原料来源于石化产品。利用微生物发酵生产丁醇在很多方面有化学合成法不可比拟的优点，微生物发酵为丁醇的工业化生产开辟了新的道路，有名的ABE发酵法(丙酮-丁醇-乙醇)曾经是世界上第二大生物发酵工程。ABE发酵法则是以粮食为原料，经发酵获得丙酮、丁醇、乙醇(质量比3:6:1)，再经精馏后分别制得丙酮、丁醇和乙醇产品。近年来随着石油价格的不断上涨，丁醇发酵工业已迎来复苏产业的大好时机。由于第一代生物能源的发展是基于粮食为原料的，这会带来生物能源与粮争地、与人争粮的问题。因此，目前迫切需要开发利用其它原料来生产生物能源的技术，即第二代生物能源技术。第二代生物能源技术的特点是利用 非粮作物即纤维素类等生物质来生产大宗的能源产品(如生物乙醇、生物丁醇等)。目前，已经有国内外研究者报道了利用各种生物质来生产丁醇的尝试，报道的生物质大多是农业废弃物，如大、小麦秸杆、玉米秸杆、玉米皮、玉米芯等。然而，利用林业废弃物来生产生物丁醇的报道非常少见。
发明内容
本发明的目的在于提高一种油桐壳生产生物丁醇的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种油桐壳生产生物丁醇的方法，包括以下步骤
(1)油桐壳收集和预处理将油桐壳收集后，晒干或烘干，经粉碎机粉碎后，过>100目筛，得过筛物油桐壳粉末；
(2)油桐壳水解按过筛物油桐壳粉末质量稀硫酸体积=1:5-9(优选1:6)的比例向过筛物油桐壳粉末中加入质量浓度为1-5%的稀硫酸(优选质量浓度为2%的稀硫酸)，在120-180°C水解1-3小时，得油桐壳水解液，控制油桐壳水解液中总糖浓度为35-45g/L ；
(3)水解液发酵培养基的配制将油桐壳水解液冷却至室温，过滤去除固形物，配制成发酵培养基；
(4)油桐壳水解液发酵将步骤(3)中配制好的培养基转入发酵罐中，然后接种预先培养好的菌种，菌种的接种量为发酵水解液培养基体积的5%-10%，在35-40°C厌氧发酵72-120 小时；
发酵所用菌种可为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792,购自德国微生物菌种保存中心)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心)，或丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的等体积混合物。进一步，步骤(3)，所述发酵培养基的配制向油桐壳水解液中加入乙酸钠直至乙酸钠浓度为3. 0-5. Og/L (优选4. Og/L),加入磷酸二氢钾直至磷酸二氢钾浓度为0. 75-0. 95g/L (优选0. 85g/L)，加入磷酸氢二钾直至磷酸氢二钾浓度为0. 75-0. 95g/L (优选0. 85g/L)，加入硫酸镁直至硫酸镁浓度为0. 20-0. 30g/L (优选0. 25g/L)，加入硫酸锰直至硫酸锰浓度为0. 01-0. 03g/L (优选0. 02g/L)，加入硫酸铁直至硫酸铁浓度为0. 01-0. 03g/L (优选 0. 02g/L)，用氨水调节 pH 值为 6. 5-7. 0，在 110_120°C灭菌 15-25 分钟。研究表明，梭菌属中丙酮丁醇梭菌(CZo1S tridium ace tobutylicum)、拜氏梭舊(Clostridium bei jerinckii)能发酵生产丁醇S. ; Shaheen, R. ; Jones,R T.，Emended descriptions of Clostridium ace tobu tyli cum and Cl os tri di umbei jerinckii, and descriptions of Cl os tri di um saccharoperbu tylace toni cumsp. nov. and Cl os tri di um saccharobutyl icum sp. nov [J]. In t. J. Sys t.EvoL Microbiol. 2001，51， (Pt 6)，2095-103. T7。丙酮丁醇梭舊(Clostridiumacetobutylicum)是低GC含量的，能形成孢子的,一种严格厌氧的革兰氏阳性细菌,它能以各种各样的糖(如葡糖糖、半乳糖、纤维二糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖)为底物进行发酵产酸(乙酸和丁酸)和溶剂(丙酮、丁醇和乙醇)\_Ezeji, T. ; Qureshi, N. ; Blaschek,H. P.，Butanol production from agricultural residues: Impact of degradationproducts on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation.BiotechnoL Bioeng. 2007，97， (6)，1460-1469.];而拜氏梭 KClostridiumbeijerinckii)的底物谱和pH适宜范围更宽，在发酵上比丙酮丁醇梭菌
况應」更具有工业应用潜力 \_Ezeji，T. C. ; Qureshi, N. ; Blaschek, KP.，Butanol fermentation research: upstream and downstream manipulations. TheChemical Record 2004，4，(5), 305-314.]。对本发明所得油桐壳水解液中的糖类(木糖、葡萄糖和阿拉伯糖)和发酵后的代谢产物(乙酸、丁酸、丙酮、丁醇、乙醇等)使用高效液相色谱(High performance LiquidChromatography, HPLC)分离鉴定,采用外标法进行定量分析。具体方法如下取出发酵过程中的样品，进行离心取上清液；上清液用Millipore Millex-GP PES (SLGP033RB)0. 22 iim针头式过滤器过滤；过滤后的上清液全自动进样，进入Agilentl200 HPLC(AgilentTechnologies公司)系统,用0. 05mM稀H2SO4作为流动相,流速0. 5mL/min,使用Bio-RadAminex HPX-87H离子交换柱(7.8X300 mm，Bio-Rad公司)，上样量5 y L，柱温控制在15°C,在30°C下使用示差折光检测器(Refractive index (RI) detector)进行信号检测。本发明之油桐壳生产生物丁醇的方法，为丁醇微生物发酵提供一条新的途径，不但可解决我国能源短缺的问题，还可避免因传统丁醇发酵生产所带来的与人争粮的问题。此外，随着桐油在国民经济中的用途日益广泛，产量的不断增长，每年将有大量的副产物油桐壳产出。利用本发明，可充分开发和利用这些油桐壳资源，在提高油桐副产物利用率的同时，减少资源浪费和环境污染。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步说明。实施例I
本实施例包括以下步骤
(1)油桐壳的收集和预处理将油桐壳收集后，晒干，经粉碎机粉碎后，过100目筛，称取过筛油桐壳粉末I. Okg ；
(2)油桐壳的水解向油桐壳粉末中加入6L质量浓度为2%的稀硫酸，混匀后装入带有冷却装置的高压反应釜中，在160°C水解I小时，得油桐壳水解液；经检测，油桐壳水解液中总糖含量为40. 6g/L ；
(3)水解液发酵培养基的配制待步骤(2)中油桐壳水解液冷却至室温后，过滤去除固形物，再向水解液中加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为4. 0g/L，加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二氢钾含量为0. 85g/L，加入磷酸氢二钾直至水解液中磷酸氢二钾含量为0. 85g/L，加入硫酸镁直至水解液中硫酸镁含量为0. 25g/L，加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0. 02g/L，加入硫酸铁直至水解液中硫酸铁含量为0. 02g/L，用氨水调节pH值为
6.8，在115°C灭菌20分钟，制成发酵培养基；
(4)油桐壳水解液发酵将步骤(3)中配制好的培养基转入发酵罐中，无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792,购自德国微生物菌种保存中心)，菌种的接种量为发酵水解液培养基体积的5%，在37°C厌氧发酵120小时，即成。本实施例所得发酵产物中溶剂(丁醇、乙醇和丙酮)的含量测定取出发酵过程中的样品，进行离心取上清液；上清液用Millipore Mi llex-GP PES (SLGP033RB) 0. 22 u m针头式过滤器过滤；过滤后的上清液全自动进样，进入Agilent 1200 HPLC (AgilentTechnologies公司)系统，用0. 05mM稀H2SO4作为流动相，流速0. 5mL/min,使用Bio-RadAminex HPX-87H离子交换柱(7. 8 X 300mm，Bio-Rad公司)，上样量5 y L，柱温控制在15°C，在30°C使用示差折光检测器(Refractive index (RI) detector)进行信号检测,采用外标法进行定量分析。发酵结果经120小时发酵后，产生丁醇7. 6g/L，乙醇I. 3g/L，丙酮3. 2g/L，总溶剂12. lg/L ;其中丁醇的比例达到62. 8%。实施例2 本实施例与实施例I的区别在于步骤(4),所用发酵菌种为拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii NCIMB 8052，购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心)。发酵结果经120小时发酵后，产生丁醇8. 3 g/L，乙醇I. lg/L,丙酮2. 9g/L，总溶剂12. 3g/L ;其中丁醇的比例达到67. 5%。实施例3
本实施例与实施例I的区别在于步骤(4)，所用发酵菌种为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792,购自德国微生物菌种保存中心)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052,购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心)等体积混合物。发酵结果经120小时发酵后，产生丁醇9. 8g/L，乙醇I. lg/L，丙酮3.4g/L，总溶剂14. 3g/L ;其中丁醇的比例达到68. 5%。
权利要求
1.一种油桐壳生产生物丁醇的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)油桐壳收集和预处理将油桐壳收集后，晒干或烘干，经粉碎机粉碎后，过>100目筛，得过筛物油桐壳粉末； (2)油桐壳水解按过筛物油桐壳粉末质量稀硫酸体积=1:5-9的比例向过筛物油桐壳粉末中加入质量浓度为1-5%的稀硫酸，120-180°C水解1-3小时，得油桐壳水解液，控制油桐壳水解液中总糖浓度为35-45g/L ； (3)水解液发酵培养基的配制将油桐壳水解液冷却至室温，过滤，去除固形物，配制成发酵培养基； (4)油桐壳水解液发酵将步骤(3)中配制好的培养基转入发酵罐中，然后接种预先培养好的菌种，菌种的接种量为发酵水解液培养基体积的5%-10%，在35-40°C厌氧发酵72-120 小时； 发酵所用菌种为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii NCIMB 8052),或丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的等体积混合物。
2.根据权利要求I所述的油桐壳生产生物丁醇的方法，其特征在于步骤(3)，所述发酵培养基的配制向油桐壳水解液中加入乙酸钠直至乙酸钠浓度为3. 5-4. 5g/L，加入磷酸二氢钾直至磷酸二氢钾浓度为0. 75-0. 95g/L，加入磷酸氢二钾直至磷酸氢二钾浓度为0. 75-0. 95 g/L，加入硫酸镁直至硫酸镁浓度为0. 20-0. 30g/L,加入硫酸锰直至硫酸锰浓度为0. 01-0. 03g/L,加入硫酸铁直至硫酸铁浓度为0. 01-0. 03g/L，用氨水调节pH值为6. 5-7. 0，在 110-120°C灭菌 15-25 分钟。
3.根据权利要求I或2所述的油桐壳生产生物丁醇的方法，其特征在于所述发酵培养基的配制向油桐壳水解液中加入乙酸钠直至乙酸钠浓度为4. Og/L，加入磷酸二氢钾直至磷酸二氢钾浓度为0. 85g/L，加入磷酸氢二钾直至磷酸氢二钾浓度为0. 85g/L，加入硫酸镁直至硫酸镁浓度为0. 25g/L，加入硫酸锰直至硫酸锰浓度为0. 02g/L，加入硫酸铁直至硫酸铁浓度为0. 02g/L，用氨水调节pH值为6. 8，在115°C灭菌20分钟。
全文摘要
一种油桐壳生产生物丁醇的方法，包括以下步骤(1)油桐壳收集和预处理；(2)油桐壳水解按过筛物油桐壳粉末质量:稀硫酸体积=1:5-9的比例向过筛物油桐壳粉末中加入质量浓度为1-5%的稀硫酸，在120-180℃水解1-3小时，得桐壳水解液，控制水解液中总糖浓度为35-45g/L；(3)水解液发酵培养基的配制；(4)油桐壳水解液发酵将步骤(3)中配制好的培养基转入发酵罐中，然后接种预先培养好的菌种，菌种的接种量为发酵水解液培养基体积的5%-10%，在35-40℃厌氧发酵72-120小时，即成。利用本发明，可提高油桐壳的利用率，减少资源浪费和环境污染。
文档编号C12R1/145GK102618586SQ201210077110
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者毛绍名, 章怀云 申请人:中南林业科技大学