专利名称：检测鸡产蛋下降综合征病毒的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测鸡产蛋下降综合征病毒的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行鸡产蛋下降综合征病毒检测的方法和试剂盒。
背景技术：
鸡产蛋下降综合征(Egg drop syndrome, EDS)又称为鸡产蛋下降综合征-76或减蛋综合征-76(Egg drop syndrome-76,EDS-76)。鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)属于腺病毒科禽腺病毒属III群(Avian adenovirus Group III)。该病的特征是鸡在性成熟前为隐性感染，鸡开产后才表现出临床症状，主要引起产蛋下降及卵壳形成不全等临床症状，引起产蛋量的巨大损失。鸡产蛋下降综合征最初只局限于欧洲，随后澳大利亚、比利时、法国、英国等国家发生该病。李刚等于1991年分离到EDSV，从而证实了 EDS在我国的存在。目前实验室检测EDS的方法主要为病原学方法、血清学方法、病毒核酸检测法，其中常用的方法是血凝试验，常用的血凝试验对象常为鸭胚尿囊液，血清学检测有特异性强，灵敏度高等特点，但是前期准备工作复杂，耗时长、试验过程繁琐，且需要有对应的抗原或抗体。随着分子生物学的迅猛发展，PCR技术得到广泛应用，李文贵等报道了套式PCR检测此病毒，其灵敏度远远高于常规PCR。Raue等用以六邻体为基础的PCR结合限制性酶切分析，成功检测和鉴别诊断了 EDSV和12种禽腺病毒。王爱华等用胶体金颗粒为标记物，制备了 EDSV胶体金试纸条并对该病毒进行了检测。董春娜等运用等温环介导扩增技术检测EDSV，其灵敏度达60个拷贝，可准确进行鸡产蛋下降综合征病毒的检测。但是传统的PCR技术在应用中还存在着不足，一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。实时荧光定量PCR(real-time PCR)则可以结合传统PCR的优点并克服不足，实现检测结果和检测样品之间的定性和定量关系，从而可以根据需要对样品进行准确定量。另夕卜，该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。TaqMan荧光定量PCR方法有望在鸡产蛋下降综合征的诊断和预防提供了一种新的方法，同时也为该病毒在自然宿主体内的致病性研究提供了一种新的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)的荧光定量PCR方法，以提高对鸡产蛋下降综合征病毒的检测能力。本发明的目的还在于提供一种检测鸡产蛋下降综合征病毒的试剂盒。本发明提供了用于检测鸡产蛋下降综合征病毒的遗传标记物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测鸡产蛋下降综合征病毒的遗传标记物。
进一步，本发明还提供用于特异性扩征上述靶序列的引物，以及与所述引物配合使用的突光探针。可以使用诸如Primer Express Version 3等软件来设计探针和引物。通常引物长度为15-30个碱基，一条引物序列与本发明提供的遗传标记物序列相同，另一条引物序列与该遗传标记物序列互补；通常Taqman探针长度为20_50个碱基，其序列与上述遗传标记物相同或互补，其5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1。本发明探针和引物不但适用于已报道的国外EDSV毒株扩增还适用国内EDSV毒株的检测。在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为Taq-EHFP :5，-GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3，(SEQ ID NO. 2)，Taq-EHRP :5’ -CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3’ (SEQ ID NO. 3)。 探针序列为5’FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3’ (SEQ ID NO. 4)。本发明提供了一种用于实时荧光定量PCR方法检测鸡产蛋下降综合征病毒的标准质粒，其含有EDSV特异性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，用于扩增该序列的特异性引物为EHF :5’ -AAACGGTGTTACCACTGAC-3’ (SEQ ID NO. 6)，EHR :5’ -AGCTGCTACCCATATCCA-3’ (SEQ ID NO. 7)。上述EDSV特异性片段选自于EDSV六邻体蛋白基因序列上高度保守的区域。将扩增出的特异性片段连接至载体后，测序结果与预期片段完全吻合。所述载体优选为pEASY-Tl 载体。本发明提供了一种检测鸡产蛋下降综合征病毒的荧光定量PCR方法，是以上述标准质粒为标准模板，以样品总DNA为模板，以上述遗传标记物(SEQ ID NO. I)为靶序列，利用引物和探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果；所述引物序列为Taq-EHFP 5，-GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3，，Taq-EHRP :5，-CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3，。探针序列为5’ FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3’。本发明提供的检测鸡产蛋下降综合征病毒的实时荧光定量PCR方法，其实时荧光定量 PCR 的 20 μ I 反应体系为Premix Ex Taq2 X buffer 12. 5 μ L，10 μ mol/L 上游引物Taq-EHFP 和 10 μ mol/L 下游引物 Taq-EHRP 各 O. 4 μ L，10 μ M 探针 O. 8 μ L, ROX 染料 O. 4 μ L，模板(质粒DNA) 2 μ L，补ddH20至20 μ L ;所述实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性30s，I个循环；95°C变性3s 5s，58°C 60°C退火30s 35s，40个循环。所述实时荧光定量PCR的优选反应程序为95°C预变性30s，I个循环；95°C变性5s，60°C退火30s，40个循环。本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用有效扩增NTC(_)ANDP0S(+)无效扩增NTC(+)AND POS (+)提示体系污染无效扩增NTC(_)AND POS(-)提示体系错误或者试剂失效。只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否者试验需要重复。
在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下Ct值小于等于38的标本为阳性结果；Ct值大于40的标本为阴性结果；Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。本发明提供了一种用于鸡产蛋下降综合征病毒检测的试剂盒，其包括上述Taq特异性引物以及配合引物使用的Taqman探针。
本发明试剂盒含有的引物，其序列为Taq-EHFP 5，-GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3，，Taq-EHRP :5，-CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3，。本发明试剂盒含有的探针，其序列为5’ FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3’。本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板EDSV总DNA，阳性模板优选为为本发明制得的标准质粒。本发明还提供了上述Taq特异性引物以及配合引物使用的Taqman探针在制备检测鸡产蛋下降综合征病毒试剂盒或检测试剂中的应用。本发明的荧光定量PCR所使用的探针及配套引物特异性强且非常稳定，反应过程中能够收集到很好的信号，且与其他病毒没有交叉反应的情况，发挥了很好的“双保险”作用。在组内及组间重复性试验中，结果显示浓度为lX108copies/y L和I X IO1Copies/μ L的模板CV值相对偏高,但仍低于2. 5%,其它浓度模板的CV值均小于I. 2%该方法最小检出量达10拷贝/yL，在I.OXlO2 I.OXlO8拷贝/yL检测范围间有良好的的线性关系，R2 = 0.992。本发明方法检测所有样本的模板浓度均在建立方法的动力学范围内，不必作对样本做任何的稀释和浓缩。EDSV人工感染鸡群试验分离样本的检测结果显示，荧光定量PCR方法的阳性检出率达到90. 6%，而常规PCR检出率为56. 3%。本发明方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。本发明方法的建立能够解决鸡产蛋下降综合征早期诊断的问题，并且能够实时地反映病毒DNA的扩增情况，动态地反映出病毒在机体组织中的分布情况。
图I为EDSV荧光定量PCR的扩增动力学曲线，其中N :阴性对照；I 8 :I. OXlO1 I. OX IO8Copies/μ L标准质粒的扩增曲线。图2为荧光定量PCR检测EDSV的标准曲线R2 = O. 992。图3为常规PCR的敏感性试验结果，I =DNA分子质量标准DNA2000plus Marker ；2 7 :1. OX IO8 I. OX IO3Copies/μ L标准模板的扩增；8 :阴性对照。图4EDSV荧光定量PCR的特异性实验结果，I 3 :标准模板的扩增曲线；4 6 :I. OX IO2Copies/μ L标准模板的扩增曲线;7 9 CIAV, DEV、MDV的扩增曲线；10 :阴性对照；11:阳性对照。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I EDSV标准质粒的构建I实验材料I. I菌株、毒种和载体 鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV) NE4株、鸡传染性贫血病毒(CIAV)CUX-I株、鸭瘟病毒(DEV)CV株、马立克氏病毒(MDV) 814株为本实验室保存；DH5 α感受态细胞由本实验室制备并保存；pEASY-Tl克隆试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。I. 2主要仪器与试剂ABI7900HT型荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司(ABI);荧光定量PCR
2XEx premix Taq试剂盒、DNA片段回收试剂盒均购于大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)；质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。2方法与结果2. I引物与探针设计根据GenBank 登录的 EDSV AV-127 株基因(Accession No. Y09598. I)序列，通过序列比对选择高度保守的六邻体蛋白编码区基因作为扩增区域，应用Primer 5.0设计I对特异引物，并由上海生工公司合成，EHF : 5 ’ -AAACGGTGTTACCACTGAC-3 ’，EHR :5’ -AGCTGCTACCCATATCCA-3’，其 PCR 扩增产物为 140bp，核苷酸序列如 SEQ ID No. 5 所示，上述引物用于构建标准质粒。2. 2病毒的增殖与鉴定将本实验保存的EDSVNE4株毒液I : 100倍稀释接种于10日龄鸭胚，O. 2mL/只，120h后收取尿囊液，以此方法，连传3代，获取的新鲜尿囊液用于血凝试验，选取血凝效价在214以上的尿囊液存于_70°C，备用。2. 3病毒DNA的提取参照李刚等[16]周锦萍，李刚，郑明球，等.鸡源和鸭源减蛋综合征病毒DNA酶切图谱分析[J].南京农业大学学报，1998，22 (2) :71 75提取尿囊液病毒DNA的方法，将纯化的病毒用SDS (10% )(终浓度为1% )-蛋白酶K(20mg/mL)消化，饱和酚/氯仿/异戊醇(25 24 I)抽提，沉淀用无水乙醇洗涤，并用TE缓冲液溶解DNA，存于-20°C保存，备用。2. 4标准模板的建立以EDSV的DNA为模板，用特异性引物EHF和EHR进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μ L，其中 CldH2O 16. 25 μ L, 10XPCR buffer2. 5 μ L, dNTP (2. 5mmol/L) 2 μ L，引物 EHF和弓丨物 EHR (均为 10 μ mol/L)各为 I μ L, EasyTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) O. 25 μ L，DNA 模板 2 μ L。PCR 反应条件预变性 94°C 3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，共 30 个循环；72°C 7min。PCR产物用1.5.%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，用引物EHF和EHR进行PCR反应扩增出的特异性片段为140bp，与预期的目的片段大小相符。用胶回收试剂盒回收并纯化基因片段。将纯化好的基因片段连接到pEASY-Tl载体上，转化至E. coli DH5 α中，经PCR鉴定后，挑取阳性克隆测序，经测序鉴定，插入的目的基因序列与已公布EDSV的AV-127毒株的六邻体蛋白基因保守序列的一致性达100%。用质粒DNA提取试剂盒提取质粒，通过紫外分光光度仪测定pEASY-Tl-edsv-h质粒浓度为O. 17μ g/μ L，A260A280 = I. 75，根据公式拷贝数=质粒浓度(g/μ L) X加样体积X阿弗加德罗常数/(质粒总长度X —个碱基对的平均分子量)，阿弗加德罗常数(每mol的微粒数)是6. 02X 1023拷贝/mol，得到质粒样品拷贝数为3. 94XlOicVyL,然后倍比稀释至1.0X10 I. OX IO8拷贝/ μ L共8个稀释度作为标准模板，_20°C保存备用。以此作为荧光定量PCR反应的标准品，该质粒命名为pEASY-Tl-edsv-h。实施例2EDSV TaqMan荧光定量PCR检测方法所用引物和探针的设计与合成
根据GenBank 登录的 EDSV AV-127 株基因(Accession No. Y09598. I)序列，通过序列比对选择高度保守的六邻体蛋白编码区基因作为扩增区域，确定用于检测EDSV的遗传标记物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示,进一步通过序列比对设计taqman探针及其配套使用的引物设计，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。所述引物序列为Taq-EHFP 5，-GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3，，Taq-EHRP :5，-CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3，。探针序列为 5，FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3，。虽然引物和探针与靶序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性的扩增出所需的片段。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明的范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明的靶序列或其片段。实施例3鸡产蛋下降综合征病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立I、实时荧光定量 PCR 的 20 μ I 反应体系为Premix Ex Taq 2Xbufferl2. 5 μ L,10 μ mol/L 上游引物 Taq-EHFP 和 10 μ mol/L 下游引物 Taq-EHRP 各 0. 4 μ L，10 μ M 探针
0.8 μ L，ROX 染料 0. 4 μ L，模板(质粒 DNA) 2 μ L，补 ddH20 M 20 μ L0实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性30s，I个循环；95°C变性5s，60°C退火30s，40个循环。2、体系标准曲线的制作将实施例I制得的标准质粒模板按照上述条件和体系进行荧光定量PCR，通过对条件的优化，精确配比模板浓度，选择最合适的退火温度，缩短加样时间，得出EDSV的荧光定量扩增动力学曲线(图I)和标准曲线(图2)。EDSV荧光定量质粒标准模板的浓度范围在I. OX IO2 I. OX IO8拷贝/ μ L之间有良好的线性关系，相关系数R2 = O. 992，扩增效率为 103. 1%ο3、结果的判定本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用有效扩增NTC(_)ANDP0S(+)无效扩增NTC(+)AND POS (+)提示体系污染
无效扩增NTC(_)AND POS(-)提示体系错误或者试剂失效。只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下Ct值小于等于38的标本为阳性结果；Ct值大于40的标本为阴性结果；Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。 实施例4 EDSV实时荧光定量PCR检测方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性评价I、敏感性试验选取10倍倍比稀释，浓度分别为I X IO1 I X IO8Copies/ μ L的标准模板，同时进行荧光定量PCR和常规PCR，观察两者的最低检出率，比较其敏感性。常规PCR反应体系为20 μ L 10 XPCR buffer2. 5 μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) 2 μ L，上下游引物(10 μ mol/L)各 I μ L，上下游引物序列分别如SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7所示，模板2 μ L，EasyTaq酶O. 25 μ L，加 ddH20 补足 20 μ L。以10倍稀释的标准质粒为模板参照实施例3的方法进行荧光定量PCR试验，得出扩增动力学曲线(图I)，显示本实验所建立的方法最低能检测到初始浓度为I. OX IOcopies/ μ L的DNA。以相同的模板进行常规PCR反应，用I. 5%琼脂糖凝胶电泳显示(图3)，能检测到初始浓度为1.0X104COpies/yL的DNA。结果说明本发明建立的荧光定量PCR方法比常规PCR方法检测EDSV敏感度高1000倍。2、特异性试验提取鸡传染性贫血病毒(CAIV)、鸭瘟病毒(DEV)、马立克氏病毒(MDV)的DNA，取等量的模板用实施例3建立的方法进行荧光定量PCR试验，同时以ddH20作阴性对照，以实施例I制得的EDSV标准质粒作阳性对照，鉴定本发明方法的特异性。挑选I. O X IO6Copies/μ L^P I. O X IO2Copies/μ L 的标准质粒，CIAV、DEV、MDV 的DNA同时进行荧光定量PCR反应。结果见图4，显示标准质粒有良好的扩增曲线及特异性，而CIAV、DEV、MDV三个阴性对照以及空白对照仅有轻微荧光信号可忽略，阳性对照有良好的扩增曲线，从而表明本实验所建立的荧光定量RT-PCR检测EDSV的方法具有良好的特异性。3、重复性及稳定性试验组间重复性试验需用相同的样品在同一反应条件下进行3次独立的荧光定量PCR检测，每个样品设置3个重复，组内重复性试验则需每个样品做3个重复，在同一反应条件下进行荧光定量PCR检测，分别计算CT值的变异系数，变异系数为标准偏差/平均数，比较重复性和稳定性。将1\101 1父108(叩化8/^14示准质粒用于组内及组间重复性试验，结果(表I)显示所有样本的重复性试验变异系数(CV)均小于2. 5%，说明本实验建立的检测EDSV的荧光定量PCR方法具有良好的重复性和稳定性。表I荧光定量PCR检测样品组间及组内重复性试验结果
权利要求
1.一种用于检测鸡产蛋下降综合征病毒的遗传标记物，其具有SEQ ID No. I所示的序列或其特异性片段。
2.用于扩增权利要求I所述遗传标记物的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的引物，其核苷酸序列为Taq-EHFP :5’ -GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3’，Taq-EHRP :5’ -CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3’。
4.与权利要求2或3所述引物配合使用的荧光探针。
5.根据权利要求4所述的荧光探针，其核苷酸序列为 . 5’ FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3’。
6.一种用于实时荧光定量PCR方法检测鸡产蛋下降综合征病毒的标准质粒，其含有EDSV特异性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，用于扩增该序列的特异性引物为EHF :5’ -AAACGGTGTTACCACTGAC-3’，EHR :5’ -AGCTGCTACCCATATCCA-3’。
7.一种鸡产蛋下降综合征病毒的检测方法，其特征在于，以权利要求6所述的标准质粒为标准模板，以样品总DNA为模板，以权利要求I所述的遗传标记物为靶序列，利用权利要求书2或3所述的引物和权利要求4或5所述探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
8.如权利要求7所述的鸡产蛋下降综合征病毒的检测方法，其特征在于，实时荧光定量 PCR 的 20 μ I 反应体系为=Premix Ex Taq2 Xbuffer 12. 5 μ L，10 μ mol/L 上游引物 EHFP和10 μ mol/L下游引物EHRP各O. 4 μ L，10 μ M探针O. 8 μ L，ROX染料O. 4 μ L，模板(质粒DNA) 2 μ L，补ddH20至20 μ L ;所述实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性30s，I个循环；95°C变性58，601退火308，40个循环。
9.含有权利要求2或3所述引物和/或权利要求4或5所述探针的试剂盒。
10.权利要求2或3所述引物和/或权利要求4或5所述探针在制备检测鸡产蛋下降综合征病毒试剂盒或检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种检测鸡产蛋下降综合征病毒的方法及其试剂盒。通过对鸡产蛋下降综合征病毒基因测序和比对，提供了用于检测鸡产蛋下降综合征病毒的遗传标记物、实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，本发明还提供了对鸡产蛋下降综合征病毒进行检测的实时荧光定量PCR方法和检测试剂盒。本发明的检测方法最小检出量达10拷贝/μL，在1.0×102～1.0×108拷贝/μL检测范围间有良好的的线性关系，R2＝0.992本发明方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。
文档编号C12N15/63GK102634605SQ20121008682
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者李刚, 李文超, 马震原 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所