紫贻贝c型溶菌酶及其制备方法

专利名称：紫贻贝c型溶菌酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及溶菌酶，具体涉及紫贻贝C型溶菌酶及其制备方法。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme，EC 3. 2. I. 17)是无脊椎动物体内非常重要的固有免疫因子之一，它主要通过切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的P -1，4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，使细胞胀裂从而引起细菌裂解。溶菌酶在机体免疫应答过程中不仅能直接杀死细菌，还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌。溶菌酶按照其来源可分为六类C (chicken)型、G (goose)型、I (invertebrate)型、植物型、细菌型和T4卩遼菌体型溶菌酶。G型溶菌酶主要存在于哺乳动物、鸟类和鱼类中，专利号为CN 2004100506518及2004100506522从扇贝中获得了 G型溶菌酶，而I型溶菌酶只存在于无脊椎动物中，C型溶 菌酶大都来自于脊椎动物。由于C型溶菌酶对各种病原菌具有较好的抑制和灭杀作用，在较低温度条件下活性较高且具有较强的热稳定性，因此在作为水产饲料添加剂和水产品保鲜剂方面具有很好的应用前景。目前，针对C型溶菌酶已开展较多研究，发现其通常含有130个左右的氨基酸残基，具有4对二硫键，三维结构呈较紧密的椭球。研究发现，Glu35、Asp52及Trp62残基是C型溶菌酶活性的必需氨基酸残基，Asp1'Arg114Jrpici8等残基对“底物-酶复合物”的形成也发挥着重要作用(Muraki M,et al，1997)。近期研究发现，鲍鱼、三疣梭子蟹等无脊椎动物也存在C型溶菌酶，并且该类型的C型溶菌酶具有较强的抑制革兰氏阴性菌活性。迄今为止，尚未有关于紫贻贝C型溶菌酶及其抗菌活性的研究报道。

发明内容
本发明提供了紫贻贝C型溶菌酶及表达基因，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示，该紫贻贝C型溶菌酶对各种病原菌具有较好的抗菌作用。本发明还提供了紫贻贝C型溶菌酶的制备方法，该制备方法能得到纯度较高的紫贻贝C型溶菌酶。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为紫贻贝C型溶菌酶，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示。表达该紫贻贝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。紫贻贝C型溶菌酶的制备方法，其步骤如下
1)总RNA提取用Trizol试剂从鳗弧菌感染的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，存于_80°C备用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；
2)mRNA纯化用OligotexmRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA ;纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；
3)cDNA模板制备用cDNASynthesis Kit试剂盒(购于Stratagene公司)将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作方法依试剂盒说明书进行包括双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II Agarose GelExtraction Kit纯化试剂盒(购于QIAGEN公司)对大于IOObp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体(购于Invetrogen公司)连接,得到cDNA质粒,用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 试剂盒(购于 Stratagene 公司)对 cDNA 质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7%的二甲基亚砜(DMSO)，得到含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ;具体包装、测定和扩增方法依试剂盒说明书进行；测序该C型溶菌酶表达基因的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；
4)基因克隆以上述含C型溶菌酶基因的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增的引物如下正向引物 5'-TTACTTGTCT TGGTACTTGT G-3'，反向引物 5'- TTTGTATGCT ATTTTATTTTG-3' ;PCR产物经胶回收试剂盒纯化回收，连接入pMD18-T载体(购于大连宝生物工程有限公司)得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌TOPlOF感受态细胞(购 于大连宝生物工程有限公司)中，挑选阳性克隆提取质粒，得到C型溶菌酶基因的克隆质粒；其中3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为10 X PCR buffer 2. 5 U 1,25I. 0 u 1,2. 5 mM 的dNTP 2.0 u IUO UM的上述正向引物溶液I yl、10 uM的通用引物17溶液I yl、浓度为5 U/ ill的Taq DNA聚合酶0. 2 U 1，所述cDNA模板溶液I Ul，用PCR水定容到25U I ;反应在ABI Veriti (购于ABI公司)中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性45秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为10 X PCR反应缓冲液2. 5 U I,25 mM的MgCl2溶液1.0 u 1,2. 5 mM的dNTP溶液2.0 u IUOuM的上述反向引物溶液
IPlUOii M的通用引物T3溶液I yl、浓度为5 U/ill的Taq DNA聚合酶0. 2 yl，所述cDNA模板溶液I yl，用PCR水定容到25 U I,反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性45秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟；上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、Taq DNA聚合酶均购自Promega公司，通用引物17、通用引物T3购自上海生工科技有限公司；
5)表达质粒构建对C型溶菌酶基因的克隆质粒进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有Afco J酶切位点的下述核苷酸序列5'_ CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA _3'，反向引物为含IAo I酶切位点和6个His纯化标签的下述核苷酸序5'-CTCGAGTTAG TGGTGGTGGTGGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT-3' ;将扩增片段纯化回收，导入pMD18_T载体中，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10F感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nco I和通o I (均购于NEB公司)双酶切亚克隆质粒；用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收，并将该片段导入经同样双酶切的表达载体pET-21a (+)(购于Novagen公司),构建得到C型溶菌酶的表达质粒；
6)表达质粒表达将上述表达质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)-plysS(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆并测序确认；挑取阳性克隆接种于LB培养基中，220rpm，37°C培养至0D600=0. 5-0. 7，加入异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使终浓度达到0. 6mM,继续培养5小时，4°C，8000rpm离心10分钟，收集菌液；
7)蛋白纯化对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤、溶解、镍柱亲和层析纯化。最后对重组蛋白进行透析复性得到具有抗菌活性的重组蛋白，即本发明的紫贻贝C型溶菌酶；经质谱测序鉴定，测得序列符合该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQID NO. I 所示。
本发明的引物由上海生物工程有限公司合成 。与现有技术相比，本发明的优点在于一种紫贻贝C型溶菌酶，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示，该紫贻贝C型溶菌酶的制备方法是通过对紫贻贝总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、基因克隆、重组质粒构建、表达质粒表达和蛋白纯化步骤得到该C型溶菌酶；该紫贻贝C型溶菌酶是一种新的C型溶菌酶，对多种革兰氏阳性和阴性微生物具有较强的抑制活性，具有开发为食品保鲜剂和饲料添加剂等方面的应用价值。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一、用Trizol试剂从鳗弧菌感染的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行取紫贻贝仔血淋巴50 ml, 2000 g离心10分钟，弃上清，向沉淀细胞中加入20 ml的TRIZOL(Invitrogen),用高速分散器将细胞分散，室温下剧烈震荡10秒；加入4 ml氯仿，剧烈震荡30秒；4°C 10，000 g高速离心10分钟；吸取上清液于一个新离心管中，加入冰浴过的等体积异丙醇(约15ml)，置于-20°C静置I小时以上；4°C 10,000 g高速离心10分钟；小心弃去上清液，用5 ml 70%的乙醇清洗沉淀；4°C10, OOOg高速离心10分钟,小心弃去上清液；真空干燥5分钟,用约600 V- I RNase-freewater溶解RNA，待完全溶解后储存于-80°C备用。二、用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA,具体纯化方法依QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行包括在37°C水浴加热OligotexSuspension,震荡混匀，室温放置；70°C水浴加热OEB Buffer ;向500 U I总RNA溶液(RNA含量约为 2mg)中加入650 u I of OBB buffer, 135 u I of Oligotex Suspension,650U I of RNase-free water，70°C加热体系3分钟；取出反应体系后，室温下放置10分钟，
15,000g离心2分钟,小心吸走上清液,用600 V- I 0W2重悬Oligotex-mRNA沉淀,剧烈震荡。然后将悬池液移入放在I. 5 ml离心管中的spin column内，15，000 g离心I分钟,将spin column转移到一个新的I. 5 ml离心管中，加入600 u I 0W2,15, 000 g离心I分钟，将spin column转移到新I. 5 ml离心管中；向spin column中加入50 U I预热到70°C的OEB buffer,轻轻混勻，15，000 g 离心 I 分钟；向 spin column 再加入 50 u I OEB buffer,混匀后15，000 g离心I分钟；回收离心管中的mRNA溶液约100 u I0三、用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作依试剂盒说明书进行包括双链cDNA末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于IOObp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行卩遼菌体包装、滴度测定和噬菌体文库扩增，具体方法参照说明书进行，扩增后的文库加入终浓度为7%的DMSO溶液，得到含有核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C备用。具体逆转录方法包括一链cDNA合成在RNase-free的200 U I离心管中依次加入试剂混匀，然后加入30 u I poly(A)引物+ RNA (5 U g)，混匀，室温下放置10分钟后，向体系中加入I. 5 ill的一链合成酶StrataScript RT (50 U/yl)，终体积达到50 u I,轻轻混匀反应体系,离心数秒,42°C温育I小时。二链合成在冰上依次向含有一链cDNA的离心管中加入需用反应物反应，再向反应体系中加入2 u I RNase H(l. 5 U/U I),Ilul DNA polymerase 1(9.0 U/ii I),轻轻混勻反应体系,离心数秒，16 V放置2. 5小时后立即将反应体系置于冰上。补平cDNA末端向二链合成体系中加入需用反应物，快速震荡反应体系离心后，于72°C反应30分钟；加入200 u I酚一氯仿[1:1 (v/v)]，震荡混匀体系，室温下高速离心2分钟，转移上清至新的离心管中；加入等体积的氯仿，震荡混匀，室温下高速离心2分钟，然后转移上清至新管中；加入下列试剂使cDNA沉淀，并震荡体系20 u I 3M sodium acetate,400 u I 100% (v/v) ethanol, - 2CTC沉淀过夜；4°C高速离心60分钟，小心弃去上清，保留沉淀；加入500 u I的70%乙醇轻轻洗涤沉淀，室温高速离心2分钟；轻轻吸去乙醇，在真空离心机中干燥沉淀；用9 U I含有EcoR I adapters的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30分钟。EcoR I接头的连接向体系中加入下列成分1 U I10 X ligase buffer, I u I IOmM rATP, I u I T4 DNA ligase (4 U/u I),离心后 8°C放置过夜；70°C 30分钟灭活连接酶。磷酸化EcoR I末端离心反应物2秒，室温放置5分钟冷却，加入下列反应物用于磷酸化接头1 V- I IOX ligase buffer, 2 u I IOmM rATP, 5 u Isterile water, 2 u I T4 polynucleotide kinase (5 U/u I), 37°C温育 30 分钟，7CTC 30分钟灭活激酶，离心2秒后室温放置5分钟冷却。Xho I内切酶酶切向体系中加入下列成分28 u I Xho I buffer supplement, 3 u I Xho I (40 U/u I), 37°C温育 I. 5 小时，加入125 u I的100% (v/v)乙醇，_20°C放置过夜，4°C离心60分钟，弃去上清，完全干燥沉淀，用 50 u I ddH20 溶解沉淀。cDNA 与载体(Uni-ZAP XR vector, Invetrogen)连接在干净的 200 u I 离心管中依次加入下列试剂2. 5 u I resuspended cDNA (>100 ng), 0. 5 U I10 X ligase buffer, 0. 5 u I 10 mM rATP (pH7. 5), I. 0 u I Uni-ZAP XR vector (I Hg)，
0.5 u I T4 DNA ligase (4 U/u 1)0 12°C放置过夜。噬菌体文库的包装从_ 80°C冰箱中取出包装蛋白，迅速用手握住融化，立即加入4 Ul重组cDNA，用微量移液器吸头混匀体系(不要产生气泡)，离心5秒，室温(22°C)温育2小时，加入500 u I的SM buff er和20 U I氯仿，轻轻混匀反应体系。快速离心数秒，沉淀蛋白碎片，转移上清至新管中。包装反应的滴度测定在含有氨苄青霉素的LB固体培养基(I升培养基含有氯化钠10 g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5 g，琼脂粉15 g，pH7. 5)上将菌株XLl-Blue MRF’划线培养，37 °C过夜培养；用LB液体培养基(I升培养基含有氯化钠10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，pH7. 5)培养单克隆菌落，30 °C, 200 rpm摇床培养过夜；4°C，1000 g下离心10分钟沉淀细菌。用25 ml 10 mM MgS04 重悬细菌；用 10 mM MgSO4 重悬 XLl-Blue MRF’ 细胞，使浓度达到 OD6tltl=0. 5 ;将包装产物按下列比例与宿主菌混合(I) I u I包装产物+ 200 u I XLl-BlueMRF，(OD600 = 0 . 5) ; (2) 0. I U I 包装产物 + 200 u I XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5);将混合体系置于37 °C温育15分钟使噬菌体充分附着在宿主细胞表面；加入3 ml融化状态下约48 1的NYZ上层培养基(I升培养基含有氯化钠5 g，MgSO4 7H20 2 g，NZ胺10 g，酵母提取物5 g，琼脂糖7 g，pH7. 5);迅速铺在干燥预热过的NYZ琼脂培养基(I升培养基、含有氯化钠5 g，MgSO4 7H20 2 g，NZ胺10 g，酵母提取物5 g，琼脂粉15 g，pH7. 5)上，静置10分钟后，倒置于37°C过夜培养；8小时后可见噬菌斑；分别计数两个平板的噬菌斑数目，计算其滴度(每毫升生长的噬菌斑数目，pfu/ml)。30°C 200 rpm条件下，用LB液体培养基过夜培养XLl-Blue MRF’细胞50 ml ； IOOOg离心宿主细胞10分钟；用25 ml 10 mMMgSO4重悬细胞，测定600纳米可见光下菌液吸光度，然后用10 mM MgSO4将菌液稀释至浓度为OD6tltl = 0. 5 ;将含有大约5 X IO4 pfu噬菌体颗粒的悬浊液与600 U I浓度为OD6tltl =
0.5的XLl-Blue MRF’细胞混合，置于Falcon2059聚丙烯管中，37°C温育混合液15分钟，使噬菌体充分附着在宿主菌表面；将混合液加入约48°C的6. 5 ml液态NZY上层培养基中，混匀后倒入新鲜的150 mm NZY琼脂糖培养基平板上，静置平板十分钟，倒转平板置于37°C约8小时(噬菌斑直径不超过2 mm);在每块平板上倒入大约10 ml SM缓冲液(I升缓冲液中含有 5. 8 g NaCl, 2. 0 g MgSO4.7H20，50. 0 ml IM Tris-HC l [pH 7. 5]，5. 0 ml 2%[w/v]白明胶)，4°C放置过夜；将所有平板上的SM缓冲液回收入新的聚丙烯管中，每块平板再用2ml SM缓冲液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入终浓度为5% (v/v)的氯仿，室温下放置15分钟，混匀，500 g离心10分钟去除细胞碎片，将上清液转移至新聚丙烯管中，并重复步骤8、9至上清液澄清，加入终浓度为7% (v/v) DMS0，储存于-80°C。测定扩增文库滴度(方法同前)。cDNA模板溶液中溶菌酶基因的确认用Exassist Helper Phage和SOLR菌株(均购于Stratagene公司)从Uni-ZAPXR Vector上体外切割，pBluescript卩遼菌粒进行体外切割；然后质粒cDNA的大规模提取和测序分析获得目的EST序列，对上述EST测序结果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根据相似性分析结果寻找出如序列表SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列的溶菌酶基因片段。 四、对上述含溶菌酶基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增得到PCR产物，PCR扩增的正向引物序列5' - TTACTTGTCTTGGTACTTGTG - 3'，反向引物的核苷酸序列为5' -TTTGTATGCTATTTTATTTTG - 3', PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，与pMD18_T载体连接获得克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌T0P10F感受态细胞中，挑选阳性克隆提取质粒，得到溶菌酶基因的克隆质粒；3'端PCR扩增的反应体系和反应条件为10 X PCR buffer 2.5ii 1、25 mM 的 MgCl2 I. 0 y 1、2. 5 mM 的 dNTP 2. 0 u 1,10 U M 的正向引物 I y I、IOy M 的通用引物 T7 I ii I、浓度为 5 U/ ii I 的 Taq DNA polymerase 0. 2 U I, cDNA 模板(文库)
Iyl，用PCR水定容到25 u I ;反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性45秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为10 X PCRbuffer 溶液 2.5 U 1,25 mM 的 MgCl2 溶液 I. 0 u 1,2. 5 mM 的 dNTP 溶液 2.0 u 1,10 u M的反向引物溶液1.0 u IUO PM的通用引物T3溶液I Pi、浓度为I U/ill的Taq DNApolymerase 0. 2 yl，所述cDNA模板溶液I yl，用PCR水定容到25 U I,反应在ABIVeritiTMPCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性45秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共进行35个循环，最后72 °C延伸10分钟；
五、对C型溶菌酶基因的克隆质粒进行PCR扩增反应，扩增反应正向引物为含有Afco I酶切位点的核苷酸序列5' - CCATGGCTACAAAMCGAAGTGCCA -3'，反向引物为含ZAo I酶切位点和 6 个 His 纯化标签的核苷酸序列 5'- CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACATGTGCTGTAATCGT -3' ;将扩增片段纯化回收，导入PMD18-T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10F感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Afco I和ZAo I (均购于NEB公司)双酶切亚克隆质粒；用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收，并将该片段导入经同样双酶切的表达载体pET_21a (+)(购于Novagen公司)，构建C型溶菌酶基因的表达质粒；测序该C型溶菌酶的表达质粒确认；
六、将上述的表达质粒转入表达宿主菌BL21(DE3) plysS中，筛选阳性克隆并经测序确认，挑取阳性克隆接种于LB液体培养基中，220 rpm，37°C培养至0D_=0. 5-0. 7，加入IPTG使终浓度达到 0. 6 mM，继续培养5 h，4°C，8000 rpm离心10分钟，收集菌液；
七、对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤、溶解、镍柱亲和层析纯化；最后对重组蛋白进行透析复性得到具有抗菌活性的重组蛋白，即本发明的紫贻贝C型溶菌酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示。具体方法为在收集的菌体沉淀中，加入适量的菌体裂解液(0. 5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl,0. 5% Triton X-IOO pH
8.5)重悬沉淀，超声波处理条件为300 W，处理200次，每次5秒，间隔10秒；菌体裂解液在41下100，00 rpm离心20分钟收集包涵体；包涵体沉淀分别用洗液I (0.5 M NaCl,10 mM Tris-HCl,0. 5% Triton X-100,2 M 尿素 pH 8.5 )和洗液 II (0.5 M NaCl, 10 mMTris-HCl,0. 5% Triton X-100，2% 脱氧胆酸钠 pH 8. 5)洗涤一次，用 8 M 尿素溶液(20 mMPBS,0. 5 M NaCl,8 M尿素，20 mM咪唑pH 7. 4)溶解；经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白采用逐渐降低尿素浓度的方法进行透析复性，透析缓冲液成分如下100 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，I mM EDTA, 2 mM还原型谷胱甘肽，0.02 mM氧化型谷胱甘肽，10%甘油，1%甘氨酸，尿素(6 M，4 M，3 M，2 M，0 M)，pH 9.0。透析缓冲液依次降低尿素的浓度，每次于4°C透析12小时，最后在TBS缓冲液(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl,pH 9.0)中透析两次。重组蛋白浓度测定采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物公司)。具体操作依试剂盒说明书进行根据样品数量，按50体积BCA试剂A加I体积BCA试剂B (50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；完全溶解蛋白标准品，取10 ill用PBS稀释至100 u 1，使终浓度为0. 5mg/ml ;将标准品按0，1,2,4,8,12，16，20 U I加到96孔板的标准品孔中，用PBS溶液补足到20 ill ;加适当体积样品到96孔板的样品孔中并用PBS补足到20 u I ;各孔加入200U I BCA工作液，37°C放置30分钟；测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。应用例
将紫贻贝C型溶菌酶加入试管中制成浓度为0. 42 mg/mL作用液，分别接种产气肠杆菌、奇异变形杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、恶臭假单胞菌以及鳗弧菌各5 u 1，使每管最终菌液浓度约为5X IO5 CFU/ml，培养24小时后，利用酶标仪测定600 nm的光吸收值，确定MIC值，得到如表I所示的结果。表I :紫贻贝C型溶菌酶的抗菌谱
硬i式菌株|MIC值(UM)~
备黄色葡萄球f 6. 95-13. 89 gl微球菌I. 74-3. 47 —
^!弧菌3. 47-6. 95
惡頁假单胞菌 I. 74-3. 47 —
奇异变形杆菌 1 47-6.95 '
尹气肠杆菌 |3. 47-6. 95
从表I中可以看出，紫贻贝C型溶菌酶对上述革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制活性，说明本发明的紫贻贝C型溶菌酶具有广谱抗菌活性，且效果较好。其中产气肠杆菌、奇异变形杆菌、藤黄微球菌以及金黄色葡萄球菌37°C培养；恶臭假单胞菌以及鳗弧菌28°C培养；具体步骤调节各菌至OD6tltl为I后，稀释1000倍备用；在96孔板中每孔中加入100Ul LB液体培养基，再在每一行第一个孔中加入100 Ul C型溶菌酶，混匀后从第一个孔中吸出100 U I加到第二个孔中，混匀后吸出100 U I加到第三个孔中，依此类推,第10个 孔中吸出的100 u I不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接种稀释好的相应菌种5 u I,第12孔为只含培养基的对照。培养24h以上，测定吸光值并计算相应的MIC。结果发现，紫贻贝C型溶菌酶对各供试菌株均表现出一定的抑制作用，其中对藤黄微球菌和恶臭假单胞菌的抑制效果最为显著，最小抑菌浓度均为I. 74-3. 47 u moL/L。
权利要求
1.紫贻贝C型溶菌酶，其特征在于该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNO. I所示。
2.权利要求I所述的紫贻贝C型溶菌酶，其特征在于表达所述的紫贻贝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。
3.权利要求I所述的紫贻贝C型溶菌酶的制备方法，其特征在于其步骤如下 1)紫贻贝总RNA的提取用Trizol试剂从鳗弧菌感染的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，存于-80 °C备用； 2)紫贻贝mRNA纯化用OligotexmRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA ； 3)紫贻贝cDNA模板制备用cDNASynthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于100 bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNAGigapack III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7%的二甲基亚砜，得到含核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ； 4)基因克隆对上述含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增，PCR扩增的引物如下正向引物序列TTACTTGTCT TGGTACTTGT G，反向引物序列TTTGTATGCT ATTTTATTTTG，3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为10 X PCR buffer 2.5 U 1,25 mM的MgCl2溶液1.0 iil、2. 5 mM的dNTP溶液2. 0 u IUO U M的上述正向引物溶液I iU、10 y M的通用引物17溶液I ii I、浓度为5 U/ ill的Taq DNA聚合酶0. 2 U 1，所述cDNA模板溶液I yl，用PCR水定容到25 u 1，反应条件为94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性45秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为10 X PCR反应缓冲液2. 5 u 1,25 mM的MgCl2溶液1.0iil、2. 5 mM的dNTP溶液2. 0 yl、10 y M的上述反向引物溶液I ylUOiiM的通用引物T3溶液I ii I、浓度为5 U/ ill的Taq DNA聚合酶0. 2 U I,所述cDNA模板溶液I Ul，用PCR水定容到25 u 1，反应条件为94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性45秒，60 V退火30秒，72°C延伸60秒，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物经胶回收试剂盒纯化，与PMD18-T载体连接得到克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10F感受态细胞中，挑选阳性克隆提取质粒，得到C型溶菌酶基因的克隆质粒； 5)表达质粒构建以上述C型溶菌酶基因的克隆质粒为模板进行PCR扩增反应，扩增反应的正向引物为含有Afco I酶切位点的核苷酸序列CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA,反向引物为含通0 I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列CTCGAGTTAG TGGTGGTGGTGGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT ;将扩增片段纯化回收，导入pMD18_T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10F感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Afco I和ZAo I双酶切亚克隆质粒；用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收,并将该片段导入经同样双酶切的表达载体pET-21a (+)中，构建得到C型溶菌酶的表达质粒； 6)表达质粒表达将上述表达质粒转入表达宿主菌BL21(DE3) plysS，筛选阳性克隆并经测序确认，将阳性克隆接种于LB培养基中，220rpm，37°C培养至0D_=0. 5-0. 7，加入异丙基-0 -D-硫代半乳糖苷，使其终浓度达到0. 6 mM,继续培养5 h，然后8000rpm离心10分钟收集菌体；7)蛋白纯化对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤和溶解，然后采用镍柱亲和层析纯化，最后对纯化产物进行透析、复性得到氨基酸序列如序列表SEQID NO. I所示的紫贻贝C型溶菌酶
全文摘要
本发明公开了一种紫贻贝C型溶菌酶及制备方法，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，该紫贻贝C型溶菌酶的制备方法是通过对紫贻贝总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、基因克隆、重组质粒构建、表达质粒表达和蛋白纯化步骤得到该C型溶菌酶；该紫贻贝C型溶菌酶是一种新的C型溶菌酶，对多种革兰氏阳性和阴性微生物具有较强的抑制活性，具有开发为食品保鲜剂和饲料添加剂等方面的应用价值。
文档编号C12R1/19GK102643787SQ20121010010
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者宋微微, 李荣华, 母昌考, 王春琳, 王春艳 申请人:宁波大学