专利名称：一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白AG的制备方法及其在抗体纯化和血液净化等领域中的应用。
背景技术：
自身免疫性疾病(Autoimmune diseases, AID)是在特定情况下,机体自身耐受机制遭到破坏，免疫系统将自身的物质错误地识别为外来有害物质，致使自身抗体和自身反应性T淋巴细胞识别并损害机体自身正常细胞、组织、器官，从而导致一系列病变。由于自身抗体和免疫复合物在自身免疫性疾病中的致病性已被证实，通过吸附剂体外清除的方式降低病人血液中自身抗体和免疫复合物的浓度能够明显改善症状，对疾病可以起到缓解和治疗作用，在临床中已得到广泛应用。蛋白A免疫吸附柱是目前在自身免疫性疾病治疗中用量最大、治疗效果最好的吸附柱。Immunosorba 和Prosorba 是两种最常用的蛋白A类免疫吸附柱,_■者均获得了美国食品药品管理局(FDA)认证，广泛用于治疗免疫球蛋白相关疾病。蛋白A免疫吸附柱的关键成分是功能基蛋白A。蛋白A (Staphylococcus aureusproteinA, SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁的组分，占整个细胞壁蛋白的6. 7%，以共价键的形式与胞壁肽聚糖相结合，分子量为42kDa，等电点pH 5. 1，易被同位素碘所标记，对热和变性因子稳定，其分子含4个酪氨酸残基，无色氨酸。不含有半胱氨酸，所以分子中不含有二硫键。蛋白A分为三个部分信号肽序列(S)，五个高度同源的IgG结合结构域(E、D、A、B、C)以及锚定蛋白结构域(X)。蛋白A能与人及多种哺乳动物血清IgG中的Fe片段结合，但亲和性各不相同，具有种系选择性。此外，其还能与血清中少量的IgM和IgA结合。同时，蛋白A与人不同类型免疫球蛋白的结合能力也不同，其对IgG的结合率为gswagGiiooG/o，IgG2100%, IgG4100%, IgG335%), IgM 51%, IgA 14%, IgE 7%。ProteinA 的结构域示意图(如图
6)然而蛋白A免疫吸附剂在30年的临床应用中也存在一些弊端，譬如其与人IgG3结合力较弱，对于一些致病抗体包含IgG3的疾病如系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病效果不显著。为了克服蛋白A吸附剂的上述缺陷，本发明将一段与人IgG3具有较强结合能力的蛋白G的基因与蛋白A的抗体结合结构域基因相连接，实现AG融合蛋白的重组表达，进而制备的融合蛋白AG吸附剂将弥补蛋白A吸附剂对IgG3结合力弱的不足，提高其对系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病的治疗效果。链球菌蛋白G (Streptococcus protein G, SPG)是一种存在于A、C、G群链球菌的细胞壁的蛋白，完整的蛋白分子量为64 65kDa，对热比较稳定，分子结构中没有二硫键，呈长纤维状。蛋白G分子中包含两至三个序列高度同源的免疫球蛋白结合域(C1、C2、C3)，位于分子的C末端，其单结构域由两对反向平行的β片层和中间的一个α螺旋组成。其分子中还包含有信号肽(S)、白蛋白结合结构域(A、B)以及细胞壁锚定蛋白结构域(W、Μ)。蛋白G具有与人和哺乳动物IgG结合的能力，与人IgG的4个亚类均具有较强结合能力，包括IgG3，但不与IgA、IgM、IgD和IgE结合。研究表明，完整的蛋白G分子可与人IgG的Fe片段以及Fab片段同时结合，还可与人血清白蛋白结合。蛋白G已广泛用作免疫学试剂，主要应用于免疫学探针以及IgG的纯化。Protein G的结构域示意图(如图7)可以看出，蛋白A与蛋白G在功能上具有互补性，两者的融合蛋白具有更好的结合特性，既可以弥补蛋白A对于IgG3结合力弱的不足，又可以弥补蛋白G不结合其它类型免疫球蛋白的不足，是更为理想的免疫球蛋白结合蛋白。融合蛋白AG结构示意图(如图8)
1988 年，Eliasson 等人(Eliasson et al. Chimeric IgG-binding ReceptorsEngineered from Staphylococcal Protein A and Strptococcal ProteinG. 1988，263(9) : 4323-4327)首次利用大肠杆菌将蛋白A与蛋白G进行融合表达，得到了包含蛋白A信号肽、5个免疫球蛋白结合区以及蛋白G的3个免疫球蛋白结合区的融合蛋白。该蛋白相对于蛋白A和蛋白G具有更为广泛的免疫球蛋白结合谱，同时也具有更强的结合能力。具体结构如图9 (A)所示，表达的融合蛋白(63kDa)在蛋白A和蛋白G之间含有一大段与免疫球蛋白结合无关的区域(llkDa)。另一种融合蛋白是将2个Z区域(将蛋白A的B区域进行改造得到，第30位氨基酸突变，F — A)与蛋白G的C1、C2和C3区域连接而得，结构如图9 (B)所示，得到的融合蛋白ZZG虽然结合谱有所扩大，但是由于抗体结合区较少，对IgG的结合能力不如前一种融合蛋白。两种融合蛋白结构示意图(如图9)。1992年，Sun和 Lew(Sun and Lew. Chimaeric protein A/protein G and proteinG/alkaline phosphatase as reportermolecules. 1992，152:43-48)利用 pGEX 载体，构建了含有谷胱甘肽-S转移酶(GST)标签、蛋白A的5个免疫球蛋白结合区以及蛋白G的2个免疫球蛋白结合区的重组融合蛋白表达质粒，利用大肠杆菌进行表达。该融合蛋白结合谱较蛋白A或蛋白G广，但是由于加入了 GST标签，导致该融合蛋白对血清中其他蛋白有非特异性吸附。一种融合蛋白结构示意图(如图10)1995年，APPLIED IMMUNE SCIENCES. INC利用化学合成方法合成了包含蛋白A的B区域及蛋白G的C3区域的蛋白SBG (21. 7kDa)，且含有部分锚定蛋白区域，具体结构如图11所示。这种融合蛋白获得了蛋白A和蛋白G的优点，但是抗体结合位点较少，片段较小，吸附效果不如蛋白 A 或蛋白 G(Chimeric Receptor Containing One IgG binding DomainOf ProteinAand Protein G. PCT/US94/09141)。一种融合蛋白结构不意图(如图 11)
2004年，上海润龙生物科技有限公司以葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B、C，大消化链球菌蛋白1^的則、82、83、84、85(高度同源的186结合结构域，主要与免疫球蛋白的κ轻链可变区结合)，C和G群链球菌蛋白G的C1、C2为结构单元，随机连接，构建重组免疫球蛋白结合分子文库。将该文库展示在噬菌体表面，并以免疫球蛋白对该文库进行3 4轮亲和筛选，获得一系列高亲和力免疫球蛋白结合分子，但是这种打乱结构单元进行重组的方法，破坏了蛋白A、蛋白G和蛋白L原有的免疫球蛋白结合位点的连续性，且抗体结合域不多于6个，吸附效果并不十分理想。而且噬菌体展示技术也存在肽库容量较小、肽库的多样性受限、氨基酸修饰受宿主菌限制等缺点(一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法，申请号 200410067157. 2)。目前，商品化的用于抗体纯化的吸附材料主要有GE公司的蛋白A吸附材料和蛋白G吸附材料，以及将蛋白A和蛋白G—起共价交联到基质上的吸附材料(protein A+proteinG,吸附量35mg IgG/mL胶)。另外,GenScript公司将一种融合蛋白AG固定于固相基质上，用于抗体的分离纯化(吸附量IOmg IgG/mL胶)，该融合蛋白含有4个蛋白A抗体结合区和2个蛋白G抗体结合区。这些吸附材料目前广泛应用于抗体纯化当中，而其在血液净化领域中的应用尚无报道。
发明内容
本发明是通过基因工程手段，将蛋白A和蛋白G的基因进行融合表达，即经过PCR扩增，连接T载体，双酶切得到编码蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合结构域的基因，然后一起连接到表达载体pET-23a上构成重组质粒，并转化大肠杆菌BL21 (DE3)，诱导表达后得到大量含有融合蛋白AG的菌体。通过超声破碎、高温加热、沉淀DNA、弱阴离子交换层析和亲和层析纯化融合蛋白AG，获得一种兼具蛋白A和蛋白G优点的融合蛋白。该蛋白可以与人不同亚类免疫球蛋白G选择性结合，且对血液中白蛋白等非免疫球蛋白物质的非特异性吸附低，结合谱更为广泛，弥补了蛋白A用于血液净化领域的不足。将其固定于固相基质表面，制备出一种用于治疗抗体类相关疾病的免疫吸附剂，此吸附剂可用于抗体的分离纯化以及血液净化领域治疗自身免疫性疾病。本发明所采用的技术方案是本发明的一方面在于公开一种融合蛋白AG基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO 5所示，大小为1470bp。本发明的一方面在于公开上述融合蛋白AG基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQID N0:6所示。蛋白A和蛋白G之间只有2个氨基酸，既不影响融合蛋白的活性，又不会引起非特异性吸附。本发明的一方面在于公开一种重组表达融合蛋白AG基因的质粒，其以pET_23a为表达载体，插入上述SEQ ID NO 5所示的融合蛋白AG基因得到的重组表达质粒。本发明采用高效表达载体pET系列进行表达，表达容易，表达量高，使得低成本、大规模生产成为可能。其中，将SEQ ID NO :5所示的融合蛋白AG基因插入到表达载体pET-23a中的具体操作过程，属于本领域技术人员能够掌握的常规技术，具体操作过程见实施例。本发明的一方面在于公开一种重组表达融合蛋白AG的重组菌株，将上述的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌株。其中，转化的具体操作步骤，属于本领域技术人员能够掌握的常规技术，具体操作过程见实施例。本发明的一方面在于公开一种利用上述的重组菌株表达融合蛋白AG的方法，其包括如下步骤利用表达载体pET-23a构建含有上述融合蛋白AG基因(即SEQ ID NO 5)的重组表达质粒；用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，经过培养、筛选得到能够表达融合蛋白AG的重组菌株；IPTG诱导蛋白表达，分离并纯化所表达的蛋白。分离并纯化所表达的蛋白之前，需要对能够表达融合蛋白AG的重组菌株进行发酵，然后离心收集菌体，再按照每克湿菌加入5mL裂解缓冲液(Tris-HCl，O. Olmol/L，pH8.0)的比例进行裂解，超声破碎后，80°C加热处理10 30min，加入终浓度为O. 08 % O. 12%的PEI溶液沉淀DNA，10, OOOrpm离心15min收集上清液，并进行超滤换液，换液后分离并纯化所表达的蛋白，其详细的操作过程见实施例。由于此部分操作为本领域技术人员所具有的常规技术，因此未限定到权利要求书中。
具体的，在上述的重组菌株表达融合蛋白AG的方法中，其所述的纯化方法为DEAE弱阴离子交换层析法处理后，再进行IgG-Fc亲和层析。DEAE弱阴离子交换层析法和IgG-Fc亲和层析法是应用于分离纯化蛋白的常用方法，其具体操作过程见实施例。本发明的一方面在于利用上述的方法制备的融合蛋白AG可应用在抗体纯化、制备吸附介质、制备血液净化吸附剂等方面。本发明的一方面在于公开一种融合蛋白AG吸附剂，其利用上述的方法制备的融合蛋白AG，将其作为配基连接到固相载体基质Siipharose CL 4B上制成吸附剂。该吸附剂解决了蛋白A吸附剂对IgG3结合力弱的不足，结合谱更为广泛，且对血清中白蛋白等非免疫球蛋白物质的非特异性吸附低，可用于抗体的分离纯化以及血液净化领域治疗自身免疫性疾病。具体的，在上述的吸附剂中，制备吸附剂的配基键合量为2 10mg/mL胶。有益效果本发明的优点在于本发明公开的用于抗体纯化和血液净化的免疫吸附剂所使用的配基蛋白为重组表达的融合蛋白AG，其不含有蛋白A的信号肽和细胞壁锚定蛋白结构域，以及蛋白G的信号肽、白蛋白结合结构域和细胞壁锚定蛋白结构域，同时，蛋白A和蛋白G之间只有2个氨基酸，没有引入大段与免疫球蛋白结合无关的区域，从而在不影响活性的前提下，避免了非免疫球蛋白结合区引起的非特异性吸附，使其对于免疫球蛋白的结合更具有选择性。同时，本发明公开了上述免疫球蛋白结合蛋白的基因工程制备方法，采用高效表达载体PET系列进行表达，表达容易，表达量高，使得低成本、大规模生产成为可能。另一方面，融合蛋白AG含有较多的抗体结合区，对抗体有较好的结合能力，以融合蛋白AG为配基的吸附剂可以更为广谱地结合免疫球蛋白，高载量的吸附血清中的抗体组分以及类风湿因子、抗核抗体等自身抗体，与现有技术相比，结合谱更广，结合力更强。同时，该吸附剂弥补了蛋白A对IgG3类抗体结合力弱的不足，可以用于血浆中自身抗体和免疫复合物的清除，并且对于一些致病抗体包含IgG3的疾病如系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病的医治效果更为显著。
图I为本发明构建的重组表达载体pET-23a_CPAG，是在载体pET_23a中连入蛋白A和蛋白G完整的抗体结合功能区基因。图2PCR扩增编码蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合区域的基因，图中显示了 spa和spg基因的大小分别在900bp和600bp左右,理论结果分别为917bp和615bp,实验结果与预期结果一致，而且PCR产物的纯度较高，特异性较好，没有非特异性条带。图3 高密度培养过程中，Ecoli BL21 (DE3) (pET_23a_CPAG)的全菌体 SDS-PAGE 凝胶电泳结果，其中泳道I为低分子量蛋白marker，泳道2为诱导前的蛋白表达，泳道3 9分别为诱导后2 6小时的蛋白表达。通过此方法，可以快速得到大量含有融合蛋白AG的菌体，具体密度可以达到60g/L(湿菌)，表达量在30%以上。表达的蛋白分子量大小约为54kDa，理论上融合蛋白AG的分子量为54336. 6Da，与预期结果一致。图4以融合蛋白AG和蛋白A为配基的吸附剂对血清中抗体的吸附效果比较，其中泳道I为低分子量蛋白marker，泳道2为融合蛋白AG吸附剂作用后的血清样品，泳道3 4分别为蛋白A吸附剂作用后的血清样品，泳道5为不经任何作用的血清样品。融合蛋白AG吸附剂对血清中免疫球蛋白的吸附效果与蛋白A吸附剂相比基本相同，都具有显著的去除效果，但是融合蛋白AG吸附剂的特异性好于蛋白A吸附剂。图5以融合蛋白AG和蛋白A为配基的吸附剂对人血清各组分的吸附效果比较。结果表明本发明融合蛋白AG吸附剂对血清中各类型免疫球蛋白的吸附效果与蛋白A吸附剂相比，规律基本相同，都具有显著的去除效果，但是融合蛋白AG吸附剂在配基键合量摩尔数低于蛋白A吸附剂的情况下，对IgG具有更高的结合容量，这也体现在融合蛋白AG吸附剂对RF的吸附上。融合蛋白AG吸附剂在对于IgG3的去除上，明显弥补了蛋白A免疫吸附剂的不足。同时，对于IgA、IgM、IgE的去除，2种吸附剂相当，可以看出，融合蛋白AG吸附剂亦弥补了蛋白G不结合除IgG外其他免疫球蛋白的不足。在对C3、C4补体和人血清白蛋白的吸附上，两种吸附剂均未显示出非特异性吸附。
图6Protein A的结构域示意图。
图7Protein G的结构域示意图。
图8融合蛋白AG结构不意图。
图9两种融合蛋白结构不意图。
图10—种融合蛋白结构示意图。
图11 一种融合蛋白结构示意图。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本文实施例中所述的试剂、实验仪器等，如无特殊说明，均由常规途径购得或常规方法制备。实施例中，为方便描述也将融合蛋白AG缩写为CPAG。实施例I :pET-23a-CPAG重组质粒的构建与鉴定以pET_23a(商品信息=Biovec, USA)作为表达载体；蛋白A基因包括免疫球蛋白 结合结构域E、D、A、B、C，不包含信号肽以及细胞壁锚定蛋白区域；蛋白G基因包括免疫球蛋白结合结构域Cl、C2、C3，不包括信号肽、白蛋白结合结构域以及细胞壁锚定蛋白区域；下面以大肠杆菌BL21(DE3)作为表达宿主，进行具体介绍。
—、含有蛋白A基因和蛋白G基因的质粒的提取含有蛋白A基因的质粒保存于E. coli BL21(DE3)_spal中，菌株为本研究室保存(林雪，蛋白A的重组表达及重组菌的发酵过程优化，硕士论文)。含有蛋白G基因的质粒由中美泰和生物技术有限公司合成，保存于E. coli DH5a (pBSK-spg)中，菌株为本研究室保存(Olsson A, Eliasson M, et al. Structure and evolution of the repetitive geneencoding streptococcal protein G. Eur. J. Biochem. 168(2),319-324(1987), PUBMED3665928，GenBank X06173. I)。质粒提取试剂盒(Code DV801A)购自宝生物工程(大连)有限公司。含有蛋白A基因和蛋白G基因的质粒的提取方法参照宝生物工程(大连)有限公司生产的质粒提取试剂盒(Code :DV801A)说明书。以含有蛋白A基因的质粒(pET-23a-spal)的提取为例，具体方法如下(I)大肠杆菌的培养。将含有pET-23a-spal的大肠杆菌接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)中，37°C过夜培 养。(2)取I 4mL的过夜培养菌液，12，OOOrpm离心2分钟，弃上清。(3)用250 μ L的Solution I (含RNaseAl)充分悬浮细菌沉淀。(4)加入250 μ L的Solution II轻轻地上下翻转混合5 6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。(5)加入400 μ L的4°C预冷的Solution III,轻轻上下翻转混合5 6次,直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。(6)室温12，OOOrpm离心10分钟，取上清。(7)将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(8)将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12, OOOrpm离心I分钟,弃滤液。(9)将 500 μ L 的 Rinse A加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 30 秒钟，弃滤液。(10)将 700 μ L 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12, OOOrpm 离心 30 秒钟，弃滤液。(11)重复操作步骤(10)。(12)将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12, OOOrpm 离心 I 分钟。(13)将Spin Column安置于新的I. 5mL的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入60 μ L的灭菌蒸懼水或Elution Buffer,室温静置I分钟。(14) 12，OOOrpm离心I分钟洗脱DNA得到含有蛋白A基因的质粒(pET-23a_spal)。含有蛋白G基因的质粒(pBSK-spg)的提取方法同含有蛋白A基因的质粒的提取。二、蛋白A基因(spa)的PCR扩增根据NCBI中收录的金黄色葡萄球菌(ATCC6538)蛋白A(SPA)的序列(登录号EU965225. 1)，利用生物学软件Primer Premier 5. O辅助设计引物。上游引物为序列SEQID NO :1所不的序列，含有Nde I酶切位点；下游引物为序列SEQ ID NO :2所不的序列，含有EcoRI酶切位点。PCR过程使用的模板为步骤(一)提取的质粒pET-23a-spal，使用的rTaq DNA聚合酶(Code =DROOlA)等均购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体反应体系如下在O. 2mL的PCR反应管中依次加入
① pET-23a-spal (50ng/[iL)I μ
⑦ rTaqDNA 聚合酶(5U/pL)0.125 ^、 ③上游引物(SEQID NO: I) (lX10-5mol/L)I μ
④下游引物(SEQIDNO:2) (lX10-5mol/L)I μ
⑤dNTP Mixture (各 2.5mM)2 μ Θ IOxPCRbuffer (Mg2+ Plus)2μL
⑦灭菌蒸馏水12.875 ^反应体系为20 μし94°C预变性5min后，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸3min,30个循环，最后72°C延伸lOmin。三、蛋白G基因(spg)的PCR扩增根据NCBI中收录的链球菌(G148)蛋白G(SPG)的序列(登录号X06173. I)，利用生物学软件Primer Premier 5· O辅助设计引物。上游引物为序列SEQ ID NO :3所示的序列，含有EcoR I酶切位点；下游引物为序列SEQ ID NO :4所示的序列，含有BamHI酶切位点。PCR过程使用的模板为步骤(一)提取的质粒pBSK-spg，使用的rTaq DNA聚合酶(Code DROOIA)等均购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。反应体系在O. 2mL的PCR反应管中依次加入
① pBSK-spg (50 ng^L)I μ ⑦ rTaqDNA聚合酶(5U/μL)0.125 μ
③上游引物(SEQIDNO:3) (lX10-5mol/L)I μ
④下游引物(SEQIDNO:4) (lX10-5mol/L)I μ
⑤dNTP Mixture (各 2.5mM)2 μIOxPCRbuffer (Mg2+ Plus) 2 μ
⑦灭菌蒸馏水12.875 μL反应体系为20 μし94で预变性5!1^11后，94で变性308，44で退火308，72で延伸3min,30个循环，最后72°C延伸lOmin。四、琼脂糖凝胶电泳I. 0%的琼脂糖凝胶，用于PCR产物的电泳，琼脂糖加热溶解后，每20mL琼脂糖溶液加入I μ LGoldview染料，摇匀后倒入模具冷却定型。取DNA 5 μ L与6XDNA凝胶加样缓冲液I μ L混匀后，上样电泳。电压5V/cm，50min后，在凝胶成像分析系统中观察結果，结果如附图2所示，图中显示了 spa和spg基因的大小分别在900bp和600bp左右，理论结果分别为917bp和615bp，实验结果与预期结果一致，而且PCR产物的纯度较高，特异性较好，没有非特异性条带。五、PCR产物的回收纯化含有编码蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合区域的基因(分别为917bp和615bp)经过I. 0%琼脂糖凝胶电泳后，进行回收，DNA回收试剂盒(Code DV805A)购自宝生物工程(大连)有限公司。含有蛋白A和蛋白G基因的DNA的回收方法參照宝生物工程(大连)有限公司生产的DNA纯化/回收试剂盒(Code DV805A)说明书。具体方法如下(I)用浓度I. 0%的琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他DNA尽可能分开，然后用干净的手木刀切下所要回收的DNA片段的琼脂块，放入1.5mL离心管中。(2)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积吋，以Img I μ L进行计算。 (3)向胶块中加入3倍胶体积的DR-I buffer. 75°C加热融化胶块，间断振荡混合，使胶块充分融化。(4)向上述胶块融化液中加入DR-I buffer量的1/2体积量的DR-II buffer，均匀混合。(5)将Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作的溶液转移至SpinColumn 中，12，OOOrpm 离心 Imin,弃滤液。(6)将 500 μ L 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12, OOOrpm 离心 30s，弃滤液。(7)将 700 μ L 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 30s,弃滤液。(8)重复(7)。(9)将Spin Column安置于新的L 5mL离心管中，在Spin Column膜的中央处加入25 μ L 的 Elution Buffer,室温放置 Imin0(10) 12，OOOrpm 离心 Imin 洗脱 DNA。得到编码蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合区域的基因spa和spg。六、T载体连接反应采用宝生物工程(大连)有限公司生产的pMD 18_T Simple Vector (Code D103A)试剂盒，将上述步骤(五)纯化得到的目的片段spa、spg,分别与载体pMD18_TVector以ー定比例混合，16°C反应数小时构建重组质粒。反应体系分别如下
① spa (50 ng^L)3 [iL
⑦ pMD 18-T VectorI [iL
③灭菌蒸馏水Iル
④solution I5 [iL16 °C反应数小时。① spg (50ng/[iL)3 μ
⑦ pMD 18-T VectorI μι
③灭菌蒸馏水Ιμ
④solution I5 μ 16 °C反应数小时。七、转化及其鉴定 将步骤(六)获得的连接产物，分别加入大肠杆菌感受态细胞(购自宝生物工程(大连)有限公司，Code D9057S)中，以热激法转化大肠杆菌，涂布于固体LB培养基表面(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉)，并于恒温培养箱中37°C恒温培养过夜。选取阳性菌落在恒温摇床中，370C，180rpm扩大培养，然后提取质粒DNA，分别命名为 pMD18-T-spa 和 pMD18_T_spg。ノV、酶切连接反应将上述提取得到的pMD 18-T-spa和pMD 18-T-spg两种质粒分别进行双酶切，同时将表达载体 pET-23a 进行双酶切。Nde I (Code D1161A), EcoRI (Code D1040A)和BamHI (Code D1010A)购自宝生物工程(大连)有限公司。酶切体系分别如下所示。重组质粒pMD18-T_spa使用Nde I和EcoR I进行双酶切进行鉴定，反应体系如下
①重组质粒 pMD 18-T-spa (50ng^L)7 μ
⑦ IOXHbufferI μ ド
Φ AfefeI (10 U/μΟI μ
④ EcoRI (15 υ/μ )I μ 酶切反应温度为30°C，时间为4h。重组质粒pMD18-T_spg使用EcoRI和BamHI进行双酶切进行鉴定，反应体系如下
①重组质粒 pMD 18-T-spg (50ng^L)7 (Λ
⑦ IOXHbufferI [iL
Φ BamHI (15 υ/μ )I [iL
④EcoRI (15U/[iL)I [iL酶切反应温度为30°C，时间为4h。pET-23a表达载体使用Nde I和BamH I进行双酶切进行鉴定，反应体系如下① pET-23a (50ng^L)7 (Λ
⑦ IOXHbufferI [iL
Φ BamHI (15 υ/μ )I [iL
④Ndel (10U/pL)I [iL·酶切反应温度为30°C，时间为4h。pMD18-T_spa、pMD18-T_spg和pET_23a双酶切后，进行I. 0%的琼脂糖凝胶电泳，方法同上(四、琼脂糖凝胶电泳)。然后采用宝生物工程(大连)有限公司生产的DNA纯化/回收试剂盒(DV805A)进行纯化，方法同上(五、PCR产物的回收纯化)。纯化后的产物(分别为spa、spg、pET-23a载体DNA)按照一定比例混合，用T4DNA连接酶在16°C下连接数小时。T4DNA连接酶(Code D2011A)购自宝生物工程(大连)有限公司。连接反应具体
体系如下
①T4 DNALigase (350 U/μΙ)I ^
⑦IO X T4 DNA Ligase bufferI ^
Φspa (50 ng^L)3.5 μ
④spg (50ng/[iL)3.5 μ
⑤pET-23a 载体 DNAI (Λ16°C，反应过夜。九、转化及其鉴定将步骤(八)获得的连接产物加入大肠杆菌感受态细胞(购自宝生物工程(大连)有限公司，Code D9057S)中，以热激法转化大肠杆菌DH5 α，涂布于固体LB培养基表面，并于恒温培养箱中37°C恒温培养过夜。选取阳性菌落在恒温摇床中，37°C, 180rpm扩大培养，然后提取质粒DNA。双酶切进行验证，产生了 1500bp左右的条带。PCR进行验证，在1500bp左右有特异条帯，效果较好。双酶切验证和PCR验证均确认与预期的蛋白A和蛋白G功能区核苷酸大小一致，大小为1470bp。将上述质粒送去宝生物工程(大连)有限公司测序验证核苷酸序列，确认与预期的蛋白A和蛋白G功能区核苷酸序列一致，将本表达质粒命名为pET-23a-CPAG，其中表达融合蛋白AG的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。将含有重组质粒的大肠杆菌命名为E. coli DH5 a (pET_23a_CPAG)。实施例2 :融合蛋白AG的表达和纯化采用宝生物工程(大连)有限公司生产的质粒提取试剂盒(Code DV801A)提取质粒pET-23a-CPAG，并以热激法转化大肠杆菌BL21 (DE3)，涂布于固体LB培养基表面，并于恒温培养箱中37°C恒温培养过夜。在超净工作台中，使用接种环挑取多个阳性克隆，接种到含有20mL LB液体培养基的50mL三角瓶中，同时加入100mg/L的氨苄青霉素，37°C摇床培养过夜。将培养好的摇瓶种子以1%接种量接入装有2L发酵培养基的发酵罐中，37°C培养。培养过程中逐渐提高搅拌转速和通气量，維持溶氧水平> 30%。当发酵液pH值和溶氧迅速上升吋，开始流加C源和N源(葡萄糖、酵母提取物)等营养物质。当0D_nm达到15 25时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至0. 2mmol/L进行诱导，诱导时间约为2 6h。开始补料后通过氨水和2mol/L硫酸溶液控制pH 6. O 8. O。通过此方法,可以快速得到大量含有融合蛋白AG的菌体，具体密度可以达到> 60g/L(湿菌)，表达量在30%以上。具体表达结果如附图3所示，表达的蛋白分子量大小约为54kDa，理论上融合蛋白AG的分子量为54336. 6Da，与预期结果一致。融合蛋白AG的氨基酸序列见SEQ ID NO :6。发酵过程中所使用的溶液配方如下
溶液等消耗品名称]配制方法
基础培养基(2 L)10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物
MgSC>4 溶液(5mL)I mol/LMgSC>4 微量培养基(20XP)I mol/LNa2HPO4, I mol/L ICH2PO4,
发酵培养基
(IOOmL)0.5 mol/L (NH4) 2S04
(2.1 L)--
10mmol/L FeCl3, MnCl2, ZnSO4, NiCl2,
金属离子(1.5mL)Na2MoO4, CaCl2, CuCl2, Na2SeO3, H3BO3
Immol/L CoCl 2
补料培养基(400 mL)30%葡萄糖，5%酵母提取物发酵后,6，OOOrpm离心5min收集菌体,然后按照姆克湿菌加入5mL裂解缓冲液(Tris-HCl，O. Olmol/L，pH 8.0)的比例进行裂解，超声进行破碎。破碎后，80°C加热处理10 30min，加入终浓度为O. 08% O. 12%的PEI溶液沉淀DNA，10, OOOrpm离心15min收集上清液，并进行超滤换液。换液后通过DEAE弱阴离子交换层析和IgG-Fc亲和层析纯化融合蛋白AG。具体层析方法如下DEAE弱阴离子交换层析(I)洗胶取偶联DEAE后的凝胶，依次用去离子水、O. lmol/L HCl溶液、O. lmol/LNaOH溶液、去离子水反复抽滤清洗，抽干后置于25mL锥形瓶内，加入去离子水使之成为悬浊液。(2)装柱使用AKTA purif ierlOO层析系统，连接好管路后，使柱子和管路中充满去离子水。边放水边加入凝胶的悬浊液，使凝胶自然沉降，液面始終高于凝胶沉降面，防止胶体中进入气泡。胶体沉降好后，保持液面高于胶面2 3毫米，密封柱子。(3)平衡用Tris缓冲液(O. Olmol/L,pH 8. O)平衡柱床，直到紫外检测器的示数不再变化为止。(4)上样将上述得到的超滤后的溶液过滤上样。上样量控制在吸附载量的20%。(5)冲洗上样结束后，继续用Tris缓冲液(O. Olmol/L, pH 8. O)冲洗5个柱床体积。(6)洗脱洗脱采用Tris缓冲液(O. Olmol/L, pH 8. O)和Tris含盐缓冲液(O.Olmol/L，含lmol/L NaCl, pH 8.0)线性洗脱，逐步洗脱柱子上吸附的蛋白，直到紫外检测器示数基本稳定，不再变化为止。回收洗脱液，測量体积。亲和层析操作方法如下所述
(I)洗胶取偶联IgG-Fc后的凝胶(贾凌云专利，申请号201010227638. O)，依次用去离子水、柠檬酸缓冲液(O. lmol/L, pH 2. 3，配制O. lmol/L柠檬酸和O. lmol/L柠檬酸钠溶液，两种溶液混合调节PH至2. 3)、去离子水反复抽滤清洗，抽干后置于25mL锥形瓶内，加入去离子水使之成为悬浊液。(2)装柱连接好管路后，使柱子和管路中充满去离子水。边放水边加入凝胶的悬浊液，使凝胶自然沉降，液面始終高于凝胶沉降面，防止胶体中进入气泡。胶体沉降好后，保持液面高于胶面2 3毫米，密封柱子。管路前接恒流蠕动泵，后接紫外检测器(事先用平衡缓冲液预冲洗，经过光强和基线调整)。(3)平衡用 PBS 缓冲液(O. Olmol/L, pH 7. 4，配制 0. OImoI/LK2HPO4 和 0. Olmol/LKH2PO4溶液，两种溶液混合调节pH至7. 4)平衡柱床，直到紫外检测器的示数不再变化为止。
(4)上样采用动态上样，即在柱床冲洗平衡后，以lOOcm/h的流速上样。当紫外检测器的示数迅速上升的时候，回收流穿液。(5)冲洗上样结束后，继续用PBS缓冲液冲洗柱床，直到紫外检测器示数基本稳定，不再变化为止，停止回收流穿液，測量流穿液体积。(6)洗脱采用一歩洗脱方式，用柠檬酸缓冲液作为洗脱液，逐步洗脱柱子上吸附的蛋白，直到紫外检测器示数基本稳定，不再变化为止。回收洗脱液，測量体积。实施例3:融合蛋白AG吸附剂的合成将上述纯化的融合蛋白AG偶联到S印harose CL 4B上，具体方法如贾凌云等人专利CN1367181A所述实施例I 4，具体方法为S印harose CL 4B (购自美国通用电气公司)为基质，经过环氧活化后连接双氨基试剂、戊ニ醛作为连接臂，然后偶联配基融合蛋白AG，
经封闭和还原后合成吸附介质-融合蛋白AG吸附剂(CPAG-Sepharose)。通过控制融合
蛋白AG的用量，控制吸附剂的配基键合量为2 10mg/mL胶。实施例4 :以融合蛋白AG和蛋白A为配基的吸附剂，对人血清各组分的吸附效果评价配基键合量为9. 93mg/mL胶的融合蛋白AG吸附剂用PBS缓冲液(O. Olmol/L, pH7.4，*0.9%NaCl)冲洗3次。评价方法为血清静态吸附(邳志前，抗体类吸附剂的合成过程优化及性能评价，硕士论文)，称取吸附剂ImL加入到盛有2mL人血清(大连医科大学附属第二医院提供)的样品瓶中，37°C温育2小吋。以S印harose CL 4B作为空白对照，平行做3次。抗体浓度采用免疫生化分析仪SIEMENS :BN ProSpec (德国)測定。检测吸附前后血清样品中各组分的浓度，并与蛋白A吸附剂(SPA-Sepharose。蛋白A自制,33kDa,根据贾凌云专利制备，申请号201010227290. 5)进行比较，具体结果如表I、附图4和附图5所
/Jn ο表ICPAG-Sepharose和SPA-Sepharose对血清中组分吸附的比较
权利要求
1.一种融合蛋白AG基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO 5所示。
2.如权利要求I所述的融合蛋白AG基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQIDNO 6所示。
3.一种重组表达融合蛋白AG基因的质粒，其特征在于以pET-23a为表达载体，插入权利要求I所述的融合蛋白AG基因得到的重组表达质粒。
4.一种重组表达融合蛋白AG的重组菌株，其特征在于由权利要求3所述的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)得到的重组菌株。
5.利用权利要求4所述的重组菌株表达融合蛋白AG的方法，其特征在于包括如下步骤利用表达载体pET-23a构建含有权利要求I所述融合蛋白AG基因的重组表达质粒；用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，经过培养、筛选得到能够表达融合蛋白AG的重组菌株；培养该菌株，IPTG诱导蛋白表达；分离并纯化所表达的蛋白。
6.根据权利要求5所述的重组菌株表达融合蛋白AG的方法，其特征在于所述的纯化方法为DEAE弱阴离子交换层析法处理后，再进行IgG-Fc亲和层析。
7.利用权利要求5所述的方法制备的融合蛋白AG可应用在抗体纯化、制备吸附介质、制备血液净化吸附剂等方面。
8.一种融合蛋白AG吸附剂，其特征在于利用权利要求5所述的方法制备的融合蛋白AG，将其作为配基连接到固相载体基质Siipharose CL 4B上制成吸附剂。
9.根据权利要求8所述的吸附剂，其特征在于其中，制备吸附剂的配基键合量为2 10mg/mL 胶。
全文摘要
本发明公开一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白制备方法及其应用，通过基因工程手段，经过PCR扩增，连接T载体，双酶切得到蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合区基因，然后一起连接到表达载体pET-23a上构成重组质粒，并转化E.coli BL21(DE3)，诱导表达后得到大量含有融合蛋白AG的菌体。通过超声破碎、高温加热、沉淀DNA、弱阴离子交换层析和亲和层析纯化得到融合蛋白AG。该蛋白具有蛋白A和蛋白G的双重优点，结合谱更为广泛，且对血清中白蛋白等非免疫球蛋白物质非特异性吸附低。将该蛋白作为配基连接到固相载体基质上制成吸附剂，解决了蛋白A吸附剂对IgG3结合力弱的不足，可用于抗体纯化以及血液净化等领域。
文档编号C12N15/63GK102676562SQ20121011813
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月21日 优先权日2012年4月21日
发明者任军, 张嘉玉, 徐丽, 谢健, 贾凌云 申请人:大连理工大学