专利名称：一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，属于植物基因工程技术领域。
背景技术：
橡胶树(HeveaBrasiliensis Mull. Arg)属于大戟科(Euphorbiaceae)橡胶树属(Hevea)，是多年生异花授粉乔木，栽培于热带地区。由于橡胶树生活周期长，从种子萌发到幼龄橡胶树开割，需要6年以上的时间，因此常规育种周期较长，一般在30年左右。利用转基因技术对巴西橡胶树进行遗传改造，可为橡胶树品种改良创造优良条件，缩短育种周期。目前，已有不少国家投入大量的人力物カ进行广泛的研究并取得了一定的进展(Leclercq J, Martin F, Lardet L, et al. benetic transformation and regeneration οι plantover-expressing Cu/inSOD geneto control oxidative stress in rubber tree. In Proceeding of InternationalRubber Conference,Siem Reap,Cambodia, 2007 ；ArokiarajP, Leelawathy R, Yeang H Y. The supervirulence plasmid pToK47 fromAgrobacteriumtumefaciens A281 improves transformation efficiency ofHevea brasiliensis [J].American Journal of Biochemistry andBiotechnology, 2009, 5 (3) : 137-141 ;黄天带，李哲，孙爱花等.根瘤农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传体系的建立.作物学报，2010，36(10) :1691-1697)。目前，巴西橡胶树遗传转化中受体材料主要以致密的花药胚性愈伤组织为主，其转化过程中仍存在很多困难，其主要的是转化效率较低，转基因植株获得率低，以及转化受体材料受花期限制等，无法满足试验和生产需要。为此，人们希望通过建立高效的遗传转化体系，来满足生产和实验的需要。然而，由于多种因素的限制，建立高效遗传转化体系仍面临诸多困难，如何解决这些困难，最終建立起稳定、高效的遗传转化体系成为目前最迫切的任务。
发明内容
本发明的目的是以巴西橡胶树优良品种的花药愈伤组织诱导的胚性细胞悬浮系为受体材料，利用根瘤农杆菌介导法进行遗传转化，经体细胞胚发生途径获得再生转基因植株。为了实现本发明目的，本发明的一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，包括如下步骤I)工程菌液的制备取_80°C保存的根瘤农杆菌菌种在添加有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB (发根农杆菌培养基)固体培养基上划线，28°C倒置培养48 72h，挑取单菌落置于添加有相同抗生素的YEB液体培养基中，28°C条件下在220rpm(转每分钟)的摇床上振荡培养24 48h至根瘤农杆菌处于对数生长期，然后取10 30ml菌液，用无菌的50ml离心管室温条件下4000rpm离心IOmin收集菌体，收集的菌体用100ml AAM培养基重悬，在相同条件下振荡培养4 6h后用新鮮的AAM培养基稀释至0D600 = O. I
O.6 (0D600为液体在600nm波长处的吸光值)作为工程菌液；2)工程菌侵染悬浮细胞将橡胶树胚性悬浮细胞去除培养基后放入20 30mlエ程菌液中浸泡I 5min，让工程菌侵染橡胶树胚性悬浮细胞；3)悬浮细胞与工程菌共培养将侵染后的橡胶树胚性悬浮细胞去除菌液并用无菌滤纸吸干后，接种到共培养基上共培养，培养温度20 25°C，培养2 8d ;4)悬浮细胞的脱菌培养经共培养的橡胶树胚性悬浮细胞用无菌水充分漂洗3 5次，尽可能去除农杆菌后，接种到脱农杆菌培养基上，25 28°C条件下暗培养15 30d，去除农杆菌并诱导产生胚性愈伤组织；
5)抗性胚性愈伤组织的筛选将诱导的胚性愈伤组织接到筛选培养基上，25 28°C暗培养，每15 30d转接到新鲜的筛选培养基上，筛选培养2 4次，挑选出抗性愈伤组织单独继续在相同培养基上继代培养；6)抗性愈伤组织诱导胚状体将继代培养后的抗性愈伤组织接到体细胞胚诱导培养基上，25 28°C条件下暗培养，每25 30d转接到新鲜的培养基上直至体细胞胚发育成熟。7)植株再生将成熟胚状体接种到再生植株培养基，25 28°C条件下光照培养，光周期为16h/d，直至长出完整再生植株。所述的共培养基的有效成分为改良的MS培养基(七水硫酸镁300 550mg/L，磷酸ニ氢钾300 500mg/L,无水氯化I丐150 550mg/L,—水硫酸猛15 45mg/L,五水硫酸铜O. I O. 35mg/L),添加2,4- ニ氯苯氧こ酸O. I 3. Omg/L, α -萘こ酸O. I 2. Omg/L,激动素O. I 3. Omg/L,肌醇O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,こ酰丁香酮50 100 μ Μ，植物凝胶2 3g/L ；所述的脱农杆菌培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸O. I 3. Omg/L, α -萘こ酸 O. I 2. Omg/L,激动素 O. I 3. Omg/L,肌醇 O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,植物凝胶2 3g/L ；所述的筛选培养基有效成分为改良的MS培养基，添加2，4_ ニ氯苯氧こ酸O. I
3.Omg/L, α -萘こ酸O. I 2. Omg/L,激动素O. I 3. Omg/L,肌醇O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,卡那霉素50 200mg/L,植物凝胶2 3g/L ；所述的体细胞胚诱导培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加激动素I. O
3.Omg/L, α -萘こ酸O. I O. 5mg/L, 6-节氨基腺嘌呤O. I 3. Omg/L,赤霉素O. I 3. Omg/L,活性炭I 2g/L，肌醇O. I O. 2g/L，椰子水30 50ml/L，蔗糖30 70g/L，植物凝胶
2 3g/L ；所述的再生植株培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加激动素O. 5 3. Omg/L, α -萘こ酸O. 01 I. Omg/L,赤霉素O. I 3. Omg/L,鹿糖50 90g/L,活性碳I 2g/し椰子水30 50ml/L，植物凝胶2 3g/L。本发明在巴西橡胶树胚性细胞悬浮系再生植株体系基本建立的基础上，建立了以巴西橡胶树胚性细胞悬浮系为受体的高效的遗传转化体系，可以获得大量均一的橡胶树遗传转化材料，为进一歩建立巴西橡胶树遗传转化育种提供重要基础。为橡胶树遗传转化育种培育产量高、抗性强且生长快的优良品种。本发明转化效率高，转基因再生植株获得率高，具有很大的应用价值。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。预先按要求配制好各种培养基和工程菌液。取-80°C保存的根瘤农杆菌EHA105 (含质粒pCambia2301-AtCBFl)菌种在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB固体培养基上划线，28°C倒置培养60h，挑取单菌落置于添加有相同抗生素的YEB液体培养基中，28°C条件下在220rpm振荡培养30h至根瘤农杆菌处于对数生长期，然后取20ml菌液，用无菌的50ml离心管室温4000rpm离心IOmin收集菌体，收集的菌体用100ml AAM培养基重悬，在相同条件下振荡培养5h后，用新鲜的AAM培养基稀释至0D600 = O. 4 (0D600为液体在600nm波长处的吸光值)作为工程菌液。、用移液枪将巴西橡胶树热研8-79胚性悬浮细胞的培养液吸干后，加入25mlエ程菌液浸泡3min，浸泡结束后用移液枪去除菌液并用无菌滤纸吸干残留菌液后，接种至共培养基上共培养。培养温度20°C，暗培养4d。共培养基为改良的MS培养基(七水硫酸镁500mg/L,磷酸ニ氢钾400mg/L,无水氯化I丐250mg/L, 一水硫酸猛35mg/L,五水硫酸铜
O.2mg/L),添加2,4- ニ氯苯氧こ酸I. Omg/L, α -萘こ酸O. 5mg/L,激动素I. 5mg/L,肌醇
0.lg/L，椰子水40ml/L，蔗糖50g/L，こ酰丁香酮75 μ Μ，植物凝胶2. 2g/L。把经过共培养的橡胶树胚性悬浮细胞用无菌水充分漂洗5次，用无菌滤纸吸干后，接种到脱农杆菌培养基上进行脱菌培养，暗培养20d，诱导出胚性愈伤组织。脱菌培养基成分为改良的MS培养基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸I. Omg/L, α -萘こ酸O. 5mg/L，激动素
1.5mg/L,肌醇O. lg/L,椰子水40ml/L,鹿糖50g/L,替卡西林400mg/L,植物凝胶2. 2g/L。将胚性愈伤组织转接到筛选培养基上筛选4次，15d筛选一次，挑选出抗性愈伤组织单独继续在相同培养基上继代培养。筛选培养基成分为改良的MS培养基，添加2，4_ ニ氯苯氧こ酸I. Omg/L, α -萘こ酸O. 5mg/L,激动素I. 5mg/L,肌醇O. lg/L,椰子水40ml/L,鹿糖50g/L,替卡西林300mg/L,卡那霉素100mg/L,植物凝胶2. 2g/L。再将继代培养后的抗性愈伤组织接到体细胞胚诱导培养基上，每25d转接到新鮮的培养基上培养，直至体细胞胚发育成熟。体细胞胚诱导培养基成分为改良的MS培养基，添加激动素2. 0mg/L, α -萘こ酸O. 2mg/L, 6-节氨基腺嘌呤L Omg/L,赤霉素2. Omg/L,活性炭I. Og/L，肌醇O. lg/L，椰子水40ml/L，蔗糖50g/L，植物凝胶2. 2g/L。然后将成熟胚状体接种到再生植株培养基上培养，培养温度28°C，光照16h/d，以促其再生出完整植株，培养IOd后，子叶形胚开始抽芽，20d后，长成健壮的完整小植株。再生植株培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加激动素I. 0mg/L, α -萘こ酸0. lmg/L,赤霉素2. 0mg/L，植物凝胶2. 2g/L，蔗糖70g/L，活性碳I. 5g/L，椰子水40ml/L。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作ー些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，其特征在于，包括如下步骤 .1)工程菌侵染悬浮细胞将橡胶树胚性悬浮细胞去除培养基后放入20 30ml工程菌液中浸泡I 5min，让工程菌侵染橡胶树胚性悬浮细胞； .2)悬浮细胞与工程菌共培养将侵染后的橡胶树胚性悬浮细胞去除菌液并用无菌滤纸吸干后，接种至共培养基上共培养，培养温度20 25°C，培养2 8d ; 所述的共培养基的有效成分为改良的MS培养基(七水硫酸镁300 550mg/L，磷酸ニ氢钾300 500mg/L,无水氯化I丐150 550mg/L,—水硫酸猛15 45mg/L,五水硫酸铜O. I O. 35mg/L),添加2，4- ニ氯苯氧こ酸O. I 3. Omg/L, α -萘こ酸O. I 2. Omg/L,激动素O. I 3. Omg/L,肌醇O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,こ酰丁香酮50 100 μ Μ，植物凝胶2 3g/L ； .3)悬浮细胞的脱菌培养经共培养的橡胶树胚性悬浮细胞用无菌水充分漂洗3 5次后，接种到脱农杆菌培养基上，25 28°C条件下暗培养15 30d，去除农杆菌并诱导产生胚性愈伤组织； 所述的脱农杆菌培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸O.I 3. Omg/L, α -萘こ酸 O. I 2. Omg/L,激动素 0. I 3. 0mg/L,肌醇 0. I 0. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,植物凝胶2 3g/L ； .4)抗性胚性愈伤组织的筛选将诱导的胚性愈伤组织接到筛选培养基上，25 28°C暗培养，每15 30d转接到新鲜的筛选培养基上，筛选培养2 4次，挑选出抗性愈伤组织单独继续在相同培养基上继代培养； 所述的筛选培养基有效成分为改良的MS培养基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸0. I .3.0mg/L, α -萘こ酸0. I 2. 0mg/L,激动素0. I 3. 0mg/L,肌醇0. I 0. 2g/L,椰子水.30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,卡那霉素50 200mg/L,植物凝胶2 3g/L ； .5)抗性愈伤组织诱导胚状体将继代培养后的抗性愈伤组织接到体细胞胚诱导培养基上，25 28°C条件下暗培养，每25 30d转接到新鲜的培养基上直至体细胞胚发育成熟； 所述的体细胞胚诱导培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加激动素I. O 3. Omg/し<!-萘こ酸0.1 0· 5mg/L, 6-节氨基腺嘌呤0. I 3. 0mg/L,赤霉素0. I 3. 0mg/L,活性炭I 2g/L，肌醇0. I 0. 2g/L，椰子水30 50ml/L，蔗糖30 70g/L，植物凝胶2 .3g/L ； .6)植株再生将成熟胚状体接种到再生植株培养基，25 28°C条件下光照培养，光周期为16h/d，直至长出完整再生植株； 所述的再生植株培养基的有效成分为改良的MS培养基，添加激动素0. 5 3. 0mg/L,α -萘こ酸0. 01 I. 0mg/L,赤霉素0. I 3. 0mg/L,鹿糖50 90g/L,活性碳I 2g/L,椰子水30 50ml/L，植物凝胶2 3g/L。
2.根据权利要求I所述的ー种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，其特征在干，工程菌液的制备是取_80°C保存的根瘤农杆菌菌种在添加有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB固体培养基上划线，28°C倒置培养48 72h，挑取单菌落置于添加有相同抗生素的YEB液体培养基中，28°C条件下在220rpm的摇床上振荡培养24 48h至根瘤农杆菌处于对数生长期，然后取10 30ml菌液，用无菌的50ml离心管室温条件下4000rpm离心IOmin收集菌体,收集的菌体用IOOmlAAM培养基重悬,在相同条件下振荡培养4 6h后用新鲜的AAM培养基稀 释至0D600 = O. I O. 6 (0D600为液体在600nm波长处的吸光值)作为工程菌液。
全文摘要
本发明涉及一种农杆菌介导的获得橡胶树转基因植株的方法，包括工程菌液的制备，工程菌侵染橡胶树胚性悬浮细胞，橡胶树胚性悬浮细胞与工程菌共培养，橡胶树胚性悬浮细胞去除农杆菌并诱导产生胚性愈伤组织，抗性胚性愈伤组织的筛选及继代培养，抗性愈伤组织诱导胚状体，将成熟胚状体培养出再生植株。本发明可为橡胶树培育产量高、抗性强且生长快的优良品种，转化效率高，再生转基因植株获得率高，具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/82GK102676574SQ20121011924
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者周权男, 姜泽海, 戴雪梅, 李哲, 毕政鸿, 谢黎黎, 黄华孙, 黄天带 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所