专利名称：一种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于食品检测领域，具体涉及ー种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒，同时还涉及ー种食品中副溶血弧菌活菌的检测方法。适用于动物性水产品、动物性水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、即食藻类食品、鱼糜制品等水产食品和水产调味品，及其他加工食品。本发明适用于水产品养殖企业、水产品加工企业、超市、农贸市场、水产品批发市场的快速检测及国家相关职能检测机构实验室检测。
背景技术：
副溶血性弧菌(Vibio parahemolyticus)广泛分布于江河、海洋及热带和温带沿海地区，主要寄生于浮游生物、鱼、虾蟹、贝类等水产品中，给水产养殖业造成巨大的经济损失。直接或间接食用被该菌污染的食品会引发肠胃功能紊乱、急性胃肠炎、浅表创伤感染、败血病等疾病，是引起食物中毒的重要病原体之一。在细菌性食物中毒的构成中，以副溶血弧菌引起的急性肠炎占首位。副溶血弧菌产生的毒素有溶血素和尿素酶。其致病因子主要有耐热直接溶血毒素、耐热直接相关溶血毒素、不耐热溶血毒素。因此，快速灵敏的检测手段是预防控制副溶血弧菌传播的关键。通常传统鉴定方法是分离培养、镜检观察、生化鉴定及嗜盐性试验等，这些检测手段不仅耗时而且操作复杂、灵敏度较低。近年来，有大量研究是基于PCR检测方法，PCR检测方法在操作时间，检测的特异性和灵敏度方面较常规方法均有较大提高，但PCR检测方法需要精密的PCR仪，它的检测时间也较长(2 4h)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地快速检测的需求。另外还有一些检测方法，比如免疫色谱法、DNA杂交法，虽然检测灵敏度高，但是所需设备和操作过程比较复杂，也不能满足实地快速检测的需求。环介导等温扩增法(LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，利用ー种链置換DNA聚合酶在等温条件(63°C左右)保温30 60min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是ー种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技木，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。现有技术中已经有副溶血弧菌检测试剂盒和检测方法，但在实际使用过程中存在着无法区分副溶血弧菌活体菌与死菌，对检测结果准确性影响很大，常出现假阳性結果。
发明内容
本发明的目的是在于提供了ー种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒，能快速检测食品中副溶血弧菌活菌，与PCR检测方法相比较，EMA-LAMP检测方法提高了检测特异性、灵敏度和准确性。与传统LAMP检测方法相比较，EMA-LAMP检测方法可以区分试样中的活菌和死菌，只检测样本中存在的副溶血弧菌活菌，检测结果更加准确，极大的降低了假阳性结果产生。同时传统LAMP检测方法其特点是针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，而本发明对传统LAMP检测方法进行了创新，其特点是针对靶基因的6个区域设计3对特异性引物，使得检测特异性、灵敏度和准确性均有较大的提高。本发明的另ー个目的是在于提供了ー种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒的检测方法，方法易行，操作简便，快速、灵敏的检测食品中副溶血弧菌活体菌，该方法在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技木，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施ー种副溶血弧菌LAMP检测试剂盒，其特征在于该试剂盒它包括以下成分10X反应缓冲液；Bst DNA聚合酶；dNTPs ；MgS04 ；DNase/RNase-Free ddH20 ;引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R ;叠氮溴化こ锭；1000XSYBR Green I荧光染料。 IOX 反应缓冲液配方200mM Tris-HClUOOmM KClUOmM(NH4)2SO4U. 0% (质量体积比)Tritonx-IOO0引物F3 :5，AGCTACTCGAAAGATGATCC 3 ’引物B3 :5 ’ GGTTGTATGAGAAGCGATTG 3，引物FIP : 5，ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT 3，引物BIP :5，ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG 3，引物Loop-F 5 ’ ACCAGTAGCCGTCAATG 3 ’引物Loop-R 5 ’ TTAGATTTGGCGAACGAGA 3 ’副溶血弧菌的环介导等温扩增，具体步骤在装有23 μ L的LAMP反应试的200 μ LPCR管中加入2 μ L待检样品DNA模板，于63°C恒温水浴箱放置60min ;扩增结果的检测方法主要有以下3种，方法I : 2% (质量体积比)的琼脂糖电泳检测是否产生连续的DNA扩增；方法2 :采用浊度仪检测管内浊度变化，可进行实时定量检测；方法3 :反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。本发明采用方法I和方法3进行检测结果的判定。ー种食品中副溶血弧菌活菌的检测方法，其步骤是(I)动物性水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、即食藻类食品、鱼糜制品等水产食品和水产调味品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取25g(25mL)样品，加入装有225mL 3.5% (质量体积比)灭菌盐水，用均质器打碎，取IOmL接种于IOOmL 3%(质量体积比)氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养基内，于37°C培养8h 16h。(2)取ImL过夜培养菌液，加入叠氮溴化こ锭(EMA)至终浓度为150 μ g/mL,暗处放置10-15min，随后将整个EP管暴露在500W卤素灯下4_6min，卤素灯离样品约15cm。整个光激发过程在冰上进行，以防止温度的升高。(3)采取DNA快速提取法提取样品中的DNA，即将叠氮溴化こ锭(EMA)处理过的菌液煮沸8-12min，短暂离心，取离心后的上清液为环介导等温扩增法(LAMP)反应的模板DNA。此方法提取DNA较简单，适用于现场采样检测，无需特殊设备。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本发明解决了现有技术检测副溶血弧菌所需周期长、检测成本高、现有副溶血弧菌检测试剂盒无法区分检测样本中副溶血弧菌是否是活菌的不足，本专利提供ー套快速检测食品中副溶血弧菌活体菌的EMA-LAMP法检测试剂盒，具有快速、高效、准确性高、灵敏度高、现场应用方便等特点，可广泛适用于食品，卫生，出入境等检测领域。实验室EMA-LAMP检测副溶血弧菌的最低检测限为IX 10CFU/mL，在现场采样检测中EMA-LAMP检测副溶血弧菌的最低检测限一般可达1X10 lX102CFU/mL，现场检测可在I. 5h内完成整个检测过程，与中华人民共和国国家标准GB/T4789. 7-2008的检测方法进行对比，其检测结果准确性一致。
图I为ー种副溶血弧菌PCR和LAMP检测结果示意图。PCR与LAMP扩增在2%琼脂糖电泳結果。泳道I 9分别以I X 109、I X 108、I X 107、I X IO6、I X 105、I X 104、I X 103、I X IO2、I X 10CFU/mL 菌悬液为模板的 PCR 扩增产物；泳道 10 为 marker (DNA 片段大小依次为 100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000,1500bp);泳道 11 19 分别以 I X 109、I X 108、I X 107、I X 106、I X 105、I X 104、I X 103、
IX 102、I X 10CFU/mL菌悬液为模板的LAMP扩增产物。图2为ー种EMA-LAMP特异性检测结果示意图。EMA-LAMP扩增在2%琼脂糖电泳結果。泳道I为marker (DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp);泳道 2 7 分别以 6 株副溶血弧菌菌悬液(I X 103CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物；泳道8 12分别以5株非副溶血弧菌的菌悬液(IX 103CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物；泳道13为阴性对照。图3为ー种热致死细胞、活细胞的EMA-LAMP扩增示意图。EMA-LAMP扩增在2 %琼脂糖电泳结果。图3A (左)泳道I为marker (DNA片段大小依次为 100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp);泳道 2 5 分别为未经过EMA处理的死菌菌悬液(I X 105、I X 104、I X IO3,1 X 102CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物。泳道6 9分别为经EMA处理的死菌菌悬液(I X 105、I X 104、I X IO3,1 X 102CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物。图3B (右)泳道I为marker (DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp);泳道2 5分别为未经EMA处理的活菌菌悬液(I X 105、I X IO4、I X 103、I X 102CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物。泳道6 9分别为经EMA处理的活菌菌悬液(I X 105、I X 104、I X IO3,1 X 102CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物。
具体实施例方式实施例I :EMA_LAMP检测试剂盒ー种副溶血弧菌EMA-LAMP检测试剂盒，该试剂盒它包括以下成分10X反应缓冲液(200mM Tris-HCl、IOOmM KClUOmM(NH4)2SO4U. O % (质量体积比)Tritonx-100，pH8· 8)、Bst DNA 聚合酶(New England Biolabs LTD) > IOmM dNTPs (New England BiolabsLTD) UOOmM MgSO4 (New England Biolabs LTD)、去离子水、引物(引物 F3、引物 B3、引物FIP、引物 BIP、引物 Loop-F、引物 Loop-R)、1.5mg/mL EMA (Sigma 公司)，1000 X SYBR GreenI荧光染料。表I引物序列表
权利要求
1.一种副溶血弧菌LAMP检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下成分10X反应缓冲液 'Bst DNA 聚合酶；dNTPs ；MgS04 ；DNase/RNase-Free ddH20 ;引物 F3、引物 B3、引物卩1 、引物81 、引物1^0 4、引物1^0 -1 ;叠氮溴化乙锭；1000\5￥81 Green I荧光染料； 所述的 IOX 反应缓冲液配方200 mM Tris-HClUOO mM KClUO mM (NH4)2S04、I. 0% 质量体积比Tritonx-IOO ； 所述的引物 F3 :5’AGCTACTCGAAAGATGATCC 3’ ；所述的引物 B3 5' GGTTGTATGAGAAGCGATTG 3’ ；所述的引物 FIP :5’ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT 3’ ；所述的引物 BIP :5’ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG 3’ ； 所述的引物 Loop-F :5’ACCAGTAGCCGTCAATG 3’ ； 所述的引物 Loop-R 5'TTAGATTTGGCGAACGAGA 3’。
2.权利要求I所述的一种食品中副溶血弧菌活菌的检测方法，其步骤是 (1)动物性水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、食藻类食品、鱼糜制品水产食品和水产调味品及加工食品经过前增菌，即以无菌操作取25 g样品，加入装有225 mL 3. 5%质量体积比灭菌盐水中，用均质器打碎，取10 mL接种于100 mL 3%质量体积比氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养基内，于37°C培养8h 16h ； (2)取ImL过夜培养菌液，加入叠氮溴化乙锭至终浓度为150 μ g/mL,暗处放置10-15min，随后将整个EP管暴露在500 W卤素灯下4_6 min，卤素灯离样品15 cm，整个光激发过程在冰上进行； (3)采取DNA快速提取法提取样品中的DNA，将叠氮溴化乙锭处理过的菌液煮沸8_12min,离心，取离心后的上清液为环介导等温扩增反应的模板DNA，提取的模板DNA适用于现场采样检测及实验室检测。
全文摘要
本发明公开了一种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括10×反应缓冲液；BstDNA聚合酶；dNTPs；MgSO4；DNase/RNase-FreeddH2O；引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R；叠氮溴化乙锭；1000×SYBRGreenI荧光染料。检测步骤(1)动物性水产品及其制品，经样品前处理后接种于氯化钠碱性蛋白胨水过夜培养；(2)取过夜培养菌液，加入叠氮溴化乙锭，暗处放置，整个光激发过程在冰上进行；(3)采取DNA快速提取法提取样品DNA，即将叠氮溴化乙锭处理过的菌悬液煮沸，离心，取离心后上清液作为环介导等温扩增反应的DNA模板，对其进行环介导等温扩增反应。本发明具有快速、高效、准确性高、灵敏度高、现场应用方便，可广泛适用于食品，卫生，出入境等检测。
文档编号C12Q1/68GK102643919SQ20121013317
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月3日 优先权日2012年5月3日
发明者张毅 申请人:湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所