利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌及其应用的制作方法

文档序号:604793阅读:667来源:国知局
专利名称:利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌及其应用的制作方法
技术领域
本发明属于工业微生物育种及其发酵技术领域,涉及一株利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌。
背景技术
丁二酸,又名琥珀酸,是一种常见的天然有机酸,广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸作为TCA循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一,在生物代谢 过程中占有非常重要的地位。近年来的研究结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、Y-丁内酯等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解聚酯。近年来,随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重,采用生物法制备丁二酸备受瞩目,美国能源部将丁二酸列为未来12种最有价值的生物炼制产品之一
相对于化学合成法,生物合成制备丁二酸的方法受到越来越多的关注。生物合成丁二酸,是利用细菌,真菌等各种微生物,以葡萄糖或其他各种水解液为碳源,经微生物发酵生产丁二酸,相对于化学合成的方法,其一大优势是原材料为酸成为近年来研究的热点。发酵产丁二酸菌株是丁二酸生物合成的关键点之一,因多数细菌和真菌都能产生丁二酸,但是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸,丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前,丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌(An^robi ospiri Ilum succini ciproducens),产丁二酸放线杆菌(ActinobaciIlus succinogenes{Corynebacterium glutam icum ) -口;^肠杆菌(Escherichia coif)等。哀中Escherichia coli由于遗传背景清楚,基因操作简单,生长速度快,易调控以及所用培养基较为廉价,近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。提高丁二酸的发酵产酸能力有很多的方法,尤其在发酵调控的手段上,很多的科研工作者都进行了深入的研究。G. N. Vemuri等人报道利用大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的方法,原理是有氧阶段是菌体得到快速积累,然后转为厌氧使菌体产生大量的丁二酸。由于两阶段发酵的局限性以及复杂性,使得一步厌氧发酵产丁二酸的研究受到越来越多的关注。然而纯厌氧条件下,大肠杆菌利用合成培养基生长并积累丁二酸的研究却鲜有报道。可见,通过改良菌株,使其可以在纯厌氧条件下利用合成培养基快速生长并大量积累产酸,在今后的丁二酸生长工业中具有举足轻重的作用。

发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一株能够在纯厌氧条件下利用合成培养基快速生长的大肠杆菌,使其可以积累丁二酸。为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下。—、一株利用合成培养基纯厌氧发酵产丁二酸的大肠杆菌,其分类命名为大肠埃希氏菌co7i) BER108,其保藏号编号为CCTCC NO M 2012068。
二、本发明所述的利用合成培养基纯厌氧发酵产丁二酸的大肠埃希氏菌Escherichia coli BER108的筛选方法,将大肠杆菌的出发菌株万.colik¥ lll经等离子体诱变后,利用合成培养基平板筛选得到能够在厌氧条件下生长的菌株,在经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产产丁二酸的菌株为目标菌株。其具体步骤如下
I)等离子诱变将大肠杆菌原始菌株疋colikWlll在试管中活化,37°C,200r/min,过夜培养;得到的菌液用无菌生理盐水稀释至OD6tltl=L 0,滴加在无菌载片上,用无菌风吹干;以氦气为放电气体,以80 120W为射频功率,以10 ^30SLM作为气体流量,以l(T30s为辐照时间,对菌株进行等离子体诱变。
2)合成培养基平板初筛将诱变后的载片置于装有ImL的生理盐水的具塞试管中,剧烈震荡,将载片上的菌液洗脱,稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上,37°C厌氧培养24h ;挑选生长较大,较为饱满的菌落。3)合成培养基平板复筛将步骤2)中筛选到的菌株在合成培养基上反复转点培养,37 °C厌氧培养24h,挑选生长较大,较为饱满的菌落。4)厌氧摇瓶发酵筛选将步骤3)中筛选出的菌株接种到种子培养基中扩大培养,370C,200r/min,培养48h,然后在发酵培养基中发酵,接种量为2% (v/v),37°C,200r/min,培养72h ;考察步骤3)中筛选出的菌落中筛选出生长速度快,产酸量高的菌株。三、利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌在发酵生长丁二酸中的应用将固体合成培养基平板培养的大肠埃希氏菌BER108接种到种子培养基中,充二氧化碳培养,37°C培养48 h得到种子液;将种子液接种到发酵培养基中,接种量2%,充二氧化碳发酵培养72h。在上述筛选方法和发酵方法中,
固体合成培养基平板:柠檬酸 3 g L-1,Na2HPO4 12H20 4 g L-1,KH2PO4 8 g L-1,(NH4)2HPO4 8 g. L' NH4Cl 0.2 g L-1,(NH4)2SO4 0. 75 g L—1,MgSO4 7H20 I g L'CaCl2 2H20 10. 0 mg I71,ZnSO4 7H20 0. 5 mg L' CuCl2 2H20 0. 25 mg L-1,MnSO4 H2O2. 5 mg I71,CoCl2 6H20 I. 75 mg L' H3BO3 0. 12 mg I71,Al2(S04 )3 I. 77 mg I71,Na2MoO4 2H20 0. 5 mg L'朽1 檬酸铁 16. I mg L—1,琼脂 20g/L,葡萄糖 10g/L。种子培养基为蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 5g/L。发酵培养基柠檬酸3 g I/1,Na2HPO4 12H20 4 g I71,KH2PO4 8 g I71,(NH4) 2HP048 g*L'NH4Cl 0.2 g.L-1,(NH4)2SO4 0. 75 g I71,MgSO4 7H20 I g I71,CaCl2 2H20 10. 0mg L' ZnSO4 7H20 0. 5 mg L' CuCl2 2H20 0. 25 mg I71,MnSO4 H2O 2. 5 mg I71,CoCl2 6H20 I. 75 mg 'T1jH3BO3 0. 12 mg L-1,Al2 (S04 )3 I. 77 mg L-1, Na2MoO4 2H20 0.5mg .L'朽1檬酸铁16. I mg I/1,碱式碳酸镁24 42g/L,葡萄糖30 40 g/L。本发明的有益效果在于
本发明使用等离子体诱变大肠杆菌,利用合成培养基平板,筛选出在厌氧条件下能够利用合成培养基快速生长,并高产丁二酸的菌株。该菌株可以以无机氮为氮源,葡萄糖为碳源在厌氧条件下快速生长,并大量积累丁二酸;在厌氧摇瓶中,可以利用合成培养基和葡萄糖生长的产酸,72h菌体密度达到了 0D_=7.6,丁二酸产量为11.2g/L,而原始出发菌株在该条件生长极其缓慢,72h菌体0D_仅为0. 34,因此该菌株具有重大的社会意义和经济价值。
具体实施方式
本发明的微生物分类命名为大肠埃希氏菌coli ) BER108,保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心,简称CCTCC,地址为中国.武汉.武汉大学。保藏日期为2012年3月8日,保藏编号为CCTCC NO M 2012068。根据以下实施例,可以更好的理解本发明。实施案例中所描述的具体的物料配比,工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明的出发菌株疋colik¥ lll的感受态菌株的来源有两处
(1)BiotechnolBioeng, 2001, 74:89 95。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处,并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授,并邮件请求其赠与该生物材料,并免费获得了该生物材料;且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料;
(2)该生物材料还在中国专利(申请号96198547.X,申请日1996. 10. 31,授权曰2003年I月I日,授权公告号CN1097632C)的专利文献中公开并获得授权。实施例I
本实施例说明将大肠埃希氏菌coli ) BER108的筛选方法。I、大肠杆菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下
将大肠杆菌疋colikWlll原始菌株在LB试管中活化,37°C,200 r/min过夜培养;取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD6tltl=L 0,滴加在无菌载片上,用无菌风吹干;以氦气为放电气体,以80 120W为射频功率,以10 30SLM作为气体流量,以l(T30s为辐照时间,对菌株进行等离子体诱变;诱变后,将载片上的菌膜用I mL的无菌生理盐水洗脱下来,涂布在合成培养基平板上,在厌氧箱中培养。在上述筛选方法中,所述的等离子体诱变方法中,优选100W为射频功率,气体流量为20SLM,辐照时间为15s。2、筛选步骤
其中,所使用的培养基配方如下
(I)固体合成培养基平板:柠檬酸 3 g L-1,Na2HPO4 12H20 4 g L-1,KH2PO4 8 g L-1,(NH4)2HPO4 8 g. L' NH4Cl 0.2 g L-1,(NH4)2SO4 0. 75 g L—1,MgSO4 7H20 I g L'CaCl2 2H20 10. 0 mg I71,ZnSO4 7H20 0. 5 mg L' CuCl2 2H20 0. 25 mg L-1,MnSO4 H2O2. 5 mg I71,CoCl2 6H20 I. 75 mg L' H3BO3 0. 12 mg I71,Al2(S04 )3 I. 77 mg I71,Na2MoO4 2H20 0. 5 mg L'朽1 檬酸铁 16. I mg L—1,琼脂 20g/L,葡萄糖 10g/L。(2)种子培养基蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 5g/L。(3)摇瓶发酵培养基:柠檬酸 3 g L—1,Na2HPO4 12H20 4 g L—1,KH2PO4 8 g L—1,(NH4)2HPO4 8 g.L' NH4Cl 0.2 g I/1,(NH4)2SO4 0. 75 g L—1,MgSO4 7H20 I g L'CaCl2 2H20 10. 0 mg I71,ZnSO4 7H20 0. 5 mg L' CuCl2 2H20 0. 25 mg L-1,MnSO4 H2O2. 5 mg I71,CoCl2 6H20 I. 75 mg L' H3BO3 0. 12 mg I71,Al2(S04 )3 I. 77 mg I71,Na2MoO4 2H20 0. 5 mg L—1,柠檬酸铁 16. I mg L—1,碱式碳酸镁 24 42g/L,葡萄糖 30 40g/L。
筛选步骤
A、合成培养基平板初筛
将诱变后的载片置于装有ImL生理盐水的具塞试管中,剧烈震荡,将载片上的菌体完全洗脱下来,稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上,37°C厌氧培养24h,挑选出挑选生长速度快,较为饱满的菌落。B、合成培养基平板复筛
将筛选到的菌株在平板上反复转点培养,最终得到了菌株BER49、BER93, BER102和BER108显示了较强的生长速率和生长稳定性。C、摇瓶发酵筛选
将菌株BER49、BER93,BER102和BER108接入种子培养基中扩大培养,充二氧化碳2min, 37°C,200r/min,培养48h。然后接种到摇瓶发酵培养基中,IOOmL厌氧血清瓶装液量30mL,接种量2%(v/v),充二氧化碳2min,37°C,200r/min,培养72h。检测各个菌株菌体密度和丁二酸产量如表I所示
__表I突变菌株和出发菌株的生长及产酸比较_
权利要求
1.一株利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌,其分类命名为大肠埃希氏菌(.EscherichiaBER108,其保藏号编号为CCTCC NO M 2012068。
2.权利要求I所述的利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌在发酵生长丁二酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于具体步骤为将固体合成培养基平板培养的大肠埃希氏菌BER108接种到种子培养基中,充二氧化碳培养,37°C培养48 h得到种子液;将种子液接种到发酵培养基中,接种量2%,充二氧化碳发酵培养72h。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述的固体合成培养基平板配方为柠檬酸 3 g 吨―1,Na2HPO4 12H20 4 g T1jKH2PO4 8 g *L_1, (NH4)2HPO4 8 g T1jNH4CI 0.2 g.L-1,(NH4)2SO4 0. 75 g L' MgSO4 7H20 I g I71,CaCl2 2H20 10. 0 mg L' ZnSO4 7H20 0. 5mg L' CuCl2 2H20 0. 25 mg L' MnSO4 H2O 2. 5 mg I71,CoCl2 6H20 I. 75 mg I71,H3BO3 0. 12 mg I71,Al2 (S04 )3 I. 77 mg I71,Na2MoO4 2H20 0. 5 mg I71,柠檬酸铁 16. Img L' 琼脂 20g/L,葡萄糖 10g/Lo
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述的种子培养基配方为蛋白胨10g/L,酵母粉 5g/L, NaCl 5g/L。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述的发酵培养基配方为柠檬酸3g L' Na2HPO4 Iffi2O 4 g L-1,KH2PO4 8 g L' (NH4)2HPO4 8 g L-1,NH4Cl 0. 2 g L-1,(NH4)2SO4 0. 75 g L' MgSO4 7H20 I g L-1,CaCl2 2H20 10. 0 mg L' ZnSO4 7H20 0. 5mg L' CuCl2 2H20 0. 25 mg L' MnSO4 H2O 2. 5 mg I71,CoCl2 6H20 I. 75 mg I71,H3BO3 0. 12 mg I71,Al2 (S04 )3 I. 77 mg I71,Na2MoO4 2H20 0. 5 mg I71,柠檬酸铁 16. Img .171,碱式碳酸镁24 42g/L,葡萄糖30 40 g/L。
全文摘要
本发明涉及一株利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌,其分类命名为埃希氏菌属大肠埃希氏菌EscherichiacoliBER108,其保藏号登记号为CCTCC NO.M2012068。本发明还公开了上述大肠杆菌在丁二酸发酵生产中的应用。本发明采用等离子体诱变大肠杆菌,利用合成培养基平板筛选出能够在厌氧条件下快速生长的菌株,该菌株可以在厌氧条件下,利用无机氮源和葡萄糖生长,并积累丁二酸。在摇瓶发酵中,以碱式碳酸镁作为PH调节剂,发酵72h,该菌株OD600达到了7.6,丁二酸产量达到11.2g/L,相对于出发菌株,丁二酸产量提高了近3倍。由于原始出发菌株在纯厌氧,合成培养基条件下,生长非常慢,产酸量也很低,因此该突变株BER108具有重大的社会意义和经济价值。
文档编号C12R1/19GK102643770SQ20121013829
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者刘嵘明, 吴明科, 姜岷, 张常青, 曹伟佳, 梅佳军, 苟冬梅, 马江锋 申请人:南京工业大学
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