专利名称：纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶及制备酒石酸的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，以及利用固定化顺式环氧琥珀酸酶生产酒石酸的方法。
背景技术：
L型或D型酒石酸是重要的手性拆分剂及化工原料。其中L(+)_酒石酸具有良好的感官特性，可以与柠檬酸、苹果酸等一起添加到果酱、糖果、饮料和葡萄酒中，是重要的食品添加剂。L型或D型酒石酸利用其光学特性还可用作药物工业原料，在现代的有机合成中作为重要的手性配体，可以用来制备许多重要的手性催化剂，并作为手性源用来合成结构复杂的产物分子。另外，酒石酸在化妆品、电镀、制革、纺织等行业也有广泛用途。因此对酒石酸的需求日益增长。 目前生产L型或D型酒石酸主要有以下几种方法天然植物提取法、化学拆分法、微生物转化葡萄糖发酵法和酶法。酶法是指用价格低廉的顺式环氧琥珀酸作为生产酒石酸的原料，在顺式环氧琥珀酸水解酶(L型或D型)或具有该酶的生物细胞催化下，使原料水解为L型或D型酒石酸。基于酶法制备酒石酸具备转化率高、专一性强、安全性好等优点，其工业化应用价值最高。但是，酶的稳定性不佳，离体纯化的酶极易失活，因此，目前顺式环氧琥珀酸水解酶的大部分应用都是采用完整细胞进行催化。但是利用完整细胞的生物转化是整个细胞中多种酶系同时作用的复杂过程，发酵过程中伴随多种副产物的生成，会影响到反应终产物的分离纯化及最终得率。单独利用固定化的顺式环氧琥珀酸水解酶专一高效生产L型或D型酒石酸具有无可替代的优势和极大的开发潜力。
发明内容
针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，以及利用固定化顺式环氧琥珀酸水解酶生产酒石酸的方法。本发明的技术方案是纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，包括以下步骤(I)在编码顺式环氧琥珀酸水解酶基因的N端或C端融合碳水化合物结合模块CBM30，得到融合表达载体；(2)将融合表达载体转化到大肠杆菌中，高效可溶性表达融合蛋白，得到目标菌体；(3)采用pH为7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤目标菌体并重悬细胞，将重悬细胞进行破碎，离心得到粗酶液；(4)将粗酶液与纤维素混合，离心得到沉淀，采用pH为7. 4的磷酸盐缓冲液淋洗沉淀并再次离心，所得沉淀即为目标产物固定化酶。优选的是，所述步骤(2)包括以下步骤a.细胞培养将大肠杆菌置于培养液中，在37°C下培养至0D600为O. 8-1. O ；b.诱导表达加入IPTG至其浓度为O. 2mM, 25°C的温度条件下诱导培养8小时；c.离心，收集菌体。优选的是，所述步骤(3)破 碎目标菌体可以采用高压细胞破碎、超声破碎或者溶菌酶破碎中的任意一种。优选的是，所述步骤⑶中的离心操作是在4°C，以10，OOOrpm的转速离心20min。优选的是，所述步骤⑷中所述纤维素与粗酶液中酶的质量比为I 0.005-1 0.02。采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶制备酒石酸的方法，包括以下步骤将纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶加入顺式环氧琥珀酸的溶液中，在PH为5-11，温度为25-70°C的条件下反应，即得到目标产物。优选的是，所述纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶为D型时，所述反应体系中还含有O. ImM-IOmM的Zn2+，所得目标产物为D型酒石酸。优选的是，制备L型酒石酸反应的最佳反应温度为30_50°C，最佳反应pH为8-10 ；制备D型酒石酸反应的最佳反应温度为30-50°C，最佳反应pH为5-9。本发明的有益效果是本发明利用纤维素作为固定化的基质，使用对纤维素具有特异的吸附作用的碳水化合物结合模块CBM30作为亲和标签，对顺式环氧琥珀酸水解酶进行融合表达并制备得到固定化酶，与非固定化的酶相比，有以下优点(I)固定化酶的同时提高了酶的纯度，改善了酶的性能，提高了酶的稳定性；(2)纤维素是一种安全的生物大分子，价格低廉，来源广泛，具备巨大的经济前景；(3)固定化酶的反应体系杂质少，有利于产物的纯化和分离，不存在底物及产物跨膜运输效率的问题。与利用完整细胞进行的生物转化相比，采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶制备酒石酸的方法具有反应具备特异性，产品纯度高，反应效率高等优点。
具体实施例方式I.纤维素固定化L型顺式环氧琥珀酸水解酶(I)在编码顺式环氧琥珀酸水解酶基因的N端或C端融合碳水化合物结合模块CBM30，得到融合表达载体；(2)在平板上挑取重组质粒转化的单菌落，接入含氨苄青霉素的培养液，37°C培养至0D600达O. 8-1. 0，加入IPTG至终浓度O. 2mM,然后转入25°C恒温摇床继续诱导培养8小时。将菌液在4°C,8000rpm条件下离心15min,收集菌体。(3)采用40ml pH为7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤目标菌体，去除残留的培养基溶液，并用20ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞，用高压细胞破碎仪将重悬细胞在22000psi压力下破壁，破碎后的菌液在4°C的温度条件和IOOOOrpm的转速下离心20min，离心得到粗酶液；(4)称取IOg微晶纤维素与IOOmL稀释至约10mg/mL的粗酶液混合，放置在4°C摇床上混合5min，离心得到沉淀，采用pH为7. 4的磷酸盐缓冲液淋洗沉淀，去除杂蛋白和未结合的目的蛋白，再次离心，所得沉淀即为目标产物固定化酶。表I固定化融合酶与原酶在不同温度下半衰期的比较
权利要求
1.纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)在编码顺式环氧琥珀酸水解酶基因的N端或C端融合碳水化合物结合模块CBM30，得到融合表达载体； (2)将融合表达载体转化到大肠杆菌中，高效可溶性表达融合蛋白，得到目标菌体； (3)采用pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤目标菌体并重悬细胞，将重悬细胞进行破碎，离心得到粗酶液； (4)将粗酶液与纤维素混合，离心得到沉淀，采用pH为7.4的磷酸盐缓冲液淋洗沉淀并再次离心，所得沉淀即为目标产物固定化酶。
2.根据权利要求I所述的纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于所 述步骤(2)包括以下步骤a.细胞培养将大肠杆菌置于培养液中，在37°C下培养至0D600为O. 8-1. O ；b.诱导表达加入IPTG至其浓度为O. 2mM，25°C的温度条件下诱导培养8小时；c.离心，收集菌体。
3.根据权利要求I所述的纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于所述步骤(3)破碎目标菌体可以采用高压细胞破碎、超声破碎或者溶菌酶破碎中的任意一种。
4.根据权利要求I所述的纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于所述步骤(3)中的离心可以在4°C的温度条件和IOOOOrpm的转速下离心20min。
5.根据权利要求I所述的纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，其特征在于所述步骤(4)中所述纤维素与粗酶液中酶的质量比为I : 0.005-1 0.02。
6.采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶制备酒石酸的方法，其特征在于包括以下步骤将纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶加入顺式环氧琥珀酸的溶液中，在PH为5-11，温度为25-70°C的条件下反应，即得到目标产物酒石酸。
7.根据权利要求6所述的采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶制备酒石酸的方法，其特征在于所述纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶为D型时，所述反应体系中还含有O. ImM-IOmM的Zn2+，所得目标产物为D型酒石酸。
8.根据权利要求7所述的采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶制备酒石酸的方法，其特征在于制备L型酒石酸反应的最佳反应温度为30-50°C，最佳反应pH为8-10 ;制备D型酒石酸反应的最佳反应温度为30-50°C，最佳反应pH为5-9。
全文摘要
本发明提供了一种纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，包括以下步骤将编码顺式环氧琥珀酸水解酶基因与碳水化合物结合模块CBM30融合，融合基因在大肠杆菌中高效表达，然后采用纤维素对粗酶液中的融合酶进行纯化固定。本发明还提供了一种采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶作为生物催化剂，催化水解环氧琥珀酸转化为L型-酒石酸或D型)-酒石酸的方法。本发明的有益效果是，采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶，不但明显提高了酶的稳定性，而且作为纯化及固定基质的纤维素价廉易得，具备良好的经济前景。采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶制备酒石酸的方法具有反应具备特异性，产品纯度高，反应效率高等优点。
文档编号C12P7/46GK102703419SQ20121015627
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者冯银刚, 崔古贞, 崔球, 王珊 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所