一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法
【专利摘要】本发明一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，涉及生物工程领域。涉及利用秸秆为主要原料，通过米曲霉（Aspergillusoryzae）发酵，生产锰过氧化物酶的方法，其生产工艺流程是秸秆经过粉碎、预湿等预处理工艺，米曲霉经过液体摇瓶培养、一级种子培养、与秸秆混合进行固态发酵，得到含有锰过氧化物酶的秸秆发酵物，酶活性3～1000U/g干发酵物，发酵物经过水提取、分子截留、冷冻干燥可以获得酶制剂粗品,酶活性达到1000～10000U/g干粗品。此发酵工艺简便，不会对环境造成污染，也不会对资源造成浪费。采用此方法制得的锰过氧化物酶可以用于降解木质素大分子结构、释放小分子物质，提高含有木质素秸秆的消化利用率，从而有助于提高秸秆的饲用价值。
【专利说明】一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程领域，特指未经高温、高压处理的秸杆培养基经发酵制备锰过氧化物酶制品，该制品用水提取，提取液经过分子截留，冷冻干燥获得锰过氧化物酶的粗品。
【背景技术】
[0002]我国是农业大国，每年农作物秸杆年产量逾6亿吨，除少量被用作纺织、造纸行业，但大部分以堆积、焚烧的形式倾入环境，既浪费了资源也给环境造成了极大地危害。
[0003]秸杆含有植物光合作用所积累的一半以上的能量，富含粗糖、粗蛋白质等有利于家畜家禽所需的成分，作为非竞争性的饲料资源，只要能够进行合理的加工调制，用来饲喂畜禽，特别是用来饲喂牛、羊等反刍家畜，有可能成为优质的饲料资源。同时，我国又是一个饲料(尤其是蛋白质饲料)严重短缺的大国，每年需进口大量的鱼粉以弥补蛋白质饲料的不足。所以能否将秸杆纤维转化为动物可利用且营养价值高的蛋白质饲料，以解决饲料需求的严重不足，就显得尤为重要。
[0004]植物的秸杆主要有木质素和纤维素构成。木质素是一类由苯酚和非苯酚结构单元通过醚键和碳碳键等连接而成的具有芳香族特性的天然聚合物，其在组分种类和连接键类型方面的多样性，意味着其结构的异质性与不规则性，也决定了对木质素进行生物降解的复杂性和特殊性，且其在植物细胞壁中与半纤维素以共价键形式结合后，将纤维素分子包埋在其中，形成坚固的天然屏障，使一般的微生物很难进入其中分解纤维素，因此，木质素的降解也是能否有效利用秸杆资源的关键因素。
[0005]目前降解秸杆的主要方法中有代表性的包括蒸汽汽爆预处理、硫酸预处理、氢氧化钠预处理、氨水预处理和生物预处理等5种方法。蒸汽汽爆则是以高压蒸汽渗入纤维内部，以气流的方式从封闭的空 隙中释放出来，纤维发生一定的机械断裂，使原料中大部分半纤维素和少量木质素、纤维素降解溶出，该方法成分较高，需要大型的设备，木质素还需要处理；酸处理法是利用硫酸水解糖苷键、酯键等，使玉米秸杆纤维的网状结构疏松，但是该方法耗用大量的有机酸或无机酸，木质素仍需要进一步处理，不适应大规模的工业化生产。碱处理和氨水处理是利用木质素溶于碱性溶液，与酸处理一样同样存在环境污染问题。这些方法普遍都存在反应条件较难掌握、反应温度高、处理时间长、占用空间大、处理效果不理想，不能去除木质纤维素等问题，近年来生物处理秸杆越来越受到人们的重视，生物降解木质素的关键是微生物能够分泌降解木质素的酶:锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶。
[0006]目前，已有不少专利涉及微生物分泌锰过氧化物酶，如专利(申请号/专利号:200810064332)介绍了强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶方法，此方法比现有的白腐真菌发酵锰过氧化物酶的方法提前了三天，发酵周期缩短了一半，酶产量高于900U/L ;专利(申请号:200680022879)目标是增加白腐担子菌生产胞外漆酶和锰过氧化物酶的产量，并降低成本，此方法相对于现有培养技术，可使漆酶和锰过氧化物酶产量显著增加；专利(申请号:200910079781)介绍了另一种锰过氧化物酶产生菌——哈茨木霉，该菌可在短期内(4-5天)形成大量分生孢子，其形成分生孢子的速度比黄孢原毛平革菌快约一周时间，且产孢子能力可以达到黄孢原毛平革菌的10倍，而黄孢原毛平革菌则是担子菌中生长和产孢子能力较强的菌种。米曲霉是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种，但是未见米曲霉分泌锰过氧化物酶的专利及其相关文献报道。
[0007]本发明人经过深入的研究，摸索出一种以秸杆为主要原料，通过米曲霉菌体固体培养获得锰过氧化物酶的方法。该方法与过去的方法不同之处在于所使用的菌种是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂的米曲霉菌种，采用秸杆作为主要原料，通过固态发酵获得含有锰过氧化物酶的发酵物制品，该制品可以经过进一步提取制得锰过氧化物酶粗品。
【发明内容】
[0008]本发明一个目的是提供了一种以米曲霉为菌种，以秸杆为原料进行固态发酵的方法，以及由该方法制备的米曲霉发酵物，该发酵物中含有锰过氧化物酶。
[0009]本发明所述的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，按照下述步骤进行:以米曲霉为出发菌株，以含有木质素的农作物秸杆为原料，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、一级种子培养和固体发酵培养，得到含有锰过氧化物酶的固态发酵物，然后进行提取得到含有锰过氧化物酶的米曲霉固体发酵物。
[0010]其中所述的菌种是米曲霉任何一种菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心(CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。
[0011]其中所述的含有木质素的农作物秸杆原料是任意一种秸杆，如玉米秸杆、稻草秸杆、麦秸杆、高粱秸杆、大豆秸杆、棉花秸杆等等，秸杆首先经过粉碎，过20-100目的筛。
[0012]其中所述的试管扩大培养工艺中，其扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基；
其中所述的液体摇瓶培养和一级种子培养的培养基均为:葡萄糖5-30克，酒石酸铵
0.1-5克，苯甲醇0.2-3克，硫酸镁0.2-I克，吐温80 0.5-10克，磷酸二氢钾2-9克，邻苯二甲酸3-18克，加水定容到I升，调pH 5-8，120-140°C灭菌20-40分钟；
其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子于装有体积比16-48%培养基的三角瓶中，在转速:150转/分，25-35°C，培养24-72小时；在进行摇瓶培养之前，首先将米曲霉菌种接入新配置的马铃薯蔗糖培养基中进行培养，培养温度25-35°C，培养时间48-144小时；4-10°C保存备用。
[0013]其中所述的一级种子培养工艺为，按I-20% (体积比)的接种量将摇瓶培养种子液接种到一级种子培养基中，在温度25-35°C，搅拌转速50-200转/分，通气量0.2-2: I体积/体积/每分钟(通气气体体积/发酵液体积/每分钟),培养18-72小时；
其中所述的固体发酵培养中培养基组成为:秸杆10千克，葡萄糖0.5-3千克，黄豆饼粉0.5-2千克；硫酸铜5-15克，硫酸亚铁5-15克，硫酸锰5-20克，水20-60千克，该培养基各成分可以按此比例放大；
其中所述的发酵工艺为:按2~20% (种子液体积/发酵培养基重量)，培养料厚度为
0.1~0.4米，料宽0.5~2米，长度不限，通气量为0.3~1.5:1 (气体体积/发酵培养基重量)/每分钟，培养时间为3天~23天，中途翻料1~2次。
[0014]其中所述的生产锰过氧化物酶粗品的工艺，将得到的固态发酵物粉碎，过20~100目筛，粉碎的发酵培养物与水按1:10~50比例混合，50~300转/分钟搅拌，5~10°c提取4~8小时，抽滤，滤渣用10~50倍的水混合，50~300转/分钟搅拌，5~10°C提取4~8小时，抽滤，两次滤液合并，通过分子量5000~10000的膜截留浓缩50~100倍，-20°C冷冻干燥，得到酶制剂粗品。
[0015]由此工艺得到的酶制剂粗品，色质白色至褐色，锰过氧化物酶活性可达到1000~10000U/g干粗品。
[0016]由本发明获得秸杆发酵物含有大量的黄绿色米曲霉孢子，发酵物桔黄色至褐色，含有酒曲香味，锰过氧化物酶活性达到3~1000U/g干发酵物。
[0017]根据本发明所述的发酵培养工艺，结合本领域的基本知识，可以根据生产需要，增加二级、三级甚至四级种子罐，进一步扩大固态发酵生产规模，以进行工业化生产。二级、三级甚至四级种子罐采用的培养基与摇瓶培养基和一级种子培养基相同，接种量为5~20%，培养条件同于一级种子培养，
采用此工艺的优点采用固态发酵，并且不经高温高压处理，这样不会给环境造成污染，也不会浪费资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本专利的工艺流程图.【具体实施方式】
[0019]根据此工艺采用的锰过氧化物酶测定方法为:准确称取I克发酵物或酶制剂粗品，溶于50mL水中，室温振汤2小时，抽滤，滤液定各至50mL,即为酶液。在4 mL反应体系中含pH 4.5 50 mmol/L的乳酸钠缓冲液3.4 mL, 1.6 mmol/L的硫酸锰溶液0.1 mL，酶液X mL,蒸懼水(0.4-X) mL预热至37°C时,加1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL启动反应。在240 nm紫外光处，测定反应4 min内OD值变化值。在对照组中，以煮沸灭活15 min酶液代替原酶液，以蒸馏水代替H2O2溶液，其他反应物不变。每分钟使I U mol/L的Mn2+转化为Mn3+所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
【权利要求】
1.一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于按照下述步骤进行:以米曲霉为出发菌株，以含有木质素的农作物秸杆为原料，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、一级种子培养和固体发酵培养，得到含有锰过氧化物酶的固态发酵物，然后进行提取得到含有锰过氧化物酶的米曲霉固体发酵物。
2.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的菌种是米曲霉任何一种菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心(CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。
3.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的含有木质素的农作物秸杆原料是任意一种秸杆，如玉米秸杆、稻草秸杆、麦秸杆、高粱秸杆、大豆秸杆、棉花秸杆等等，秸杆首先经过粉碎，过20-100目的筛。
4.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的试管扩大培养工艺中，其扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基。
5.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的液体摇瓶培养和一级种子培养的培养基均为:葡萄糖5-30克，酒石酸铵0.1-5克，苯甲醇0.2-3克，硫酸镁0.2-I克，吐温80 0.5-10克，磷酸二氢钾2-9克，邻苯二甲酸3-18克，加水定容到I升，调pH 5-8，120-140°C灭菌20-40分钟。
6.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子于装有体积比16-48%培养基的三角瓶中，在转速:150转/分，25-35°C，培养24-72小时；在进行摇瓶培养之前，首先将米曲霉菌种接入新配置的马铃薯蔗糖培养基中进行培养，培养温度25-35°C，培养时间48-144小时；4-10°C保存备用。
7.根据权利要求1所述 的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的一级种子培养工艺为，按体积比I-20%的接种量将摇瓶培养种子液接种到一级种子培养基中，在温度25-35°C，搅拌转速50-200转/分，通气量0.2-2:1体积/体积/每分钟(通气气体体积/发酵液体积/每分钟),培养18-72小时。
8.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的固体发酵培养中培养基组成为:秸杆10千克，葡萄糖0.5-3千克，黄豆饼粉0.5-2千克；硫酸铜5-15克，硫酸亚铁5-15克，硫酸锰5-20克，水20-60千克，该培养基各成分可以按此比例放大。
9.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的发酵工艺为:按2-20% (种子液体积/发酵培养基重量)，培养料厚度为0.1-0.4米，料宽0.5-2米，长度不限，通气量为0.3-1.5:1 (气体体积/发酵培养基重量)/分钟，培养时间为3天-23天，中途翻料I-2次。
10.根据权利要求1所述的一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的生产锰过氧化物酶粗品的工艺，将得到的固态发酵物粉碎，过20-100目筛，粉碎的发酵培养物与水按1:10-50比例混合，50-300转/分钟搅拌，5-10°C提取4-8小时，抽滤，滤渣用10-50倍的水混合，50-300转/分钟搅拌，5-10°C提取4-8小时，抽滤，两次滤液合并，通过分子量5000-10000的膜截留浓缩50-100倍，-20°C冷冻干燥，得到酶制剂粗 品。
【文档编号】C12R1/69GK103451162SQ201210169836
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月29日 优先权日:2012年5月29日
【发明者】张志才, 陈钧, 任晓锋, 李佳少, 黄达明 申请人:江苏大学