专利名称：与冠心病易感性显著关联的易感区域chr5p15的单核苷酸多态性位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及与疾病易感性相关联的单核苷酸多态性位点，特别涉及一种与冠心病易感性关联的易感区域Chr5pl5的单核苷酸多态性位点及其在评估冠心病易感性中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
动脉粥样硬化性心脑血管病已成为世界范围关注的主要健康问题。2004年的世界卫生组织(WHO)报告显示，全世界每年心血管疾病以冠心病和脑卒中为主导致的死亡人 数达高达1720万，占所有死亡人数的三分之一。预计2020年这一数字将进一步增加50%，高达2500万，心血管疾病是全球人类的“头号杀手”。在中国进行的一项大规模前瞻性研究也显示，心脏疾病已经成为中国人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第I位。我国每年新发心肌梗死50万人，随着生活方式的改变以及动脉粥样硬化相关的危险因素持续增加，冠心病与心肌梗死发病也还将呈持续上升趋势。大量的研究资料表明，冠心病是一种复杂疾病，是由多个微效基因与环境因素长期相互作用所致。因此鉴定出与冠心病相关的易感基因或致病基因，在人群中进一步筛选增加疾病风险的易感基因确定易感个体，将有助于冠心病的发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗。从基础到临床，人们对此进行了大量的研究，并在冠心病的危险因素和冠心病发生的病理生理学方面积累了大量的知识，但是关于冠心病与心肌梗死发生的确切遗传分子机制却知之甚少，对于怎样鉴定遗传易感基因以及鉴定受试者的冠心病遗传易感性，一直缺乏全面系统有效的识别方法。
发明内容
本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一系列与冠心病易感性显著相关的单核苷酸多态性位点(SNP, single nucleotide polymorphism),并找出其中与冠心病易感性关联最显著的代表性位点，继而提供将所述单核苷酸多态性位点用于评估冠心病易感性的用途。为了实现上述目的本发明采取的技术方案是第一方面，提供一系列与冠心病易感性显著相关的易感区域chr5pl5的单核苷酸多态性位点(SNP)。在中国汉族人群中选取1515例冠心病患者和5019例正常人为研究对象，使用全基因组芯片(Affymetrix Axiom Genome-Wide CHB I Array Plate)芯片对全基因组范围内SNP进行基因分型。利用芯片得到的数据，评价基因型和表型的关联关系，从而得到可能与冠心病之间存在潜在关联的区域是在染色体5pl5上的TRIO基因区域的一段紧密连锁区域内的一系列单核苷酸多态性SNP位点，为rsll7297784，等位基因为A/G ;为rsl058312，等位基因为A/G ;为rs9942367，等位基因为A/T ;为rsl7500919，等位基因为C/T ;为rslll33787，等位基因为 C/T。
第二方面,使用logistic回归分析评估每个SNP位点与冠心病的关系,计算危险等位基因的相对危险度(Odds ratio, OR)和95%的可信区间，得到这一系列SNP位点的危险等位基因分别是rsll7297784多态性位点为G，rsl058312多态性位点为A，rs9942367多态性位点为T，rsl7500919多态性位点为T，rsl 1133787多态性位点为T。第三方面，选择Chr5pl5区域代表位点rsl 17297784，在数据分析中使用Haploview软件计算染色体区域位点间的连锁不平衡(Linkage disequilibrium, LD)情况。该区域 rsl 17297784 多态性位点与 rsl058312，rs9942367, rsl7500919,rslll33787，具有较强的连锁不平衡。同时使用FludigmOEPl基因分析系统(FludigmOEP1 GENETICANALYSIS system), TaqmanMGB 探针法进行基因分型，进一步在 11211 例冠心病患者和7286例对照样本中验证，合并所有12726例病例和12305对照样本分析显示rsll7297784与冠心病的关联更加显著，这一结果进一步证实了 Chr5pl5区域多态位点与冠心病密切相关。第四方面，根据上述与冠心病易感性显著相关的单核苷酸多态性位点，构建单体型(haplotype)比较其在患者和正常对照之间的频率差异，用以评估冠心病易感性。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是根据本发明染色体5pl5由一段TRIO基因区域的SNP位点以及由一系列SNP位点组成的单体型的变异特性判断冠心病易感人群的方法，可以对未出现冠心病早期临床症状的人群，尤其具有传统危险因素的冠心病高危人群，进行无创快速简便的筛查，早期发现冠心病易感对象，并采取相应的保健措施，降低冠心病与心肌梗死的发病率。根据本发明也可以为研发针对性的冠心病基因治疗提供了科学依据。本发明为进一步检测基因表达调控、蛋白功能，深入研究冠心病的致病机制，开发新型治疗药物和基因治疗，实现基于遗传学背景的个体化诊疗奠定了重要基础，并带来重要的医学健康效益和经济效益。
图I为实施例I中所确定的chr5pl5区域SNP位点与冠心病的关联图。图2为在实施例2的重复验证阶段的检测中，其中96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)的代表位点rsll7297784基因分型结果聚类图；图3 为应用 SNP Genotyping Analysis software version 3. 0 软件对图 2 所述的96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)的代表位点rsll7297784进行基因分型的截图；图4为图2所述的96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)代表位点rsll7297784基因分型结果导出数据的截图。图I中横坐标为5号染色体上的位置(chromosome 5position),单位为(kb)；纵坐标左侧为单核苷酸多态性位点与冠心病的关联显著性P值(-Iogici(P-Value)),右侧Recombination rate为重组率,单位(CM/Mb);代表位点rsl842896以 表示。图2中X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光强度；基因型结果红色I为A/A纯合子，绿色2为G/G纯合子，蓝色3为A/G杂合子，黑色4为阴性对照(NTC)。其中横坐标X :Allele为等位基因，VIC-MGB代表VIC荧光标记MGB探针；纵坐标Y =Allele为等位基因，FAM-MGB为FAM荧光标记MGB探针；上方表示SNP位点、call rate为这张芯片上该位点检出率，Auto Confidence为软件给出的自动判别基因型的可信度；下方Chip Run Name为实验中采用的EPl芯片名称。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例I确定与冠心病易感性显著关联的单核苷酸多态性位点、等位基因及其危险等位基因一、方法首先在中国汉族人群中选取1515例冠心病患者和5019例正常人为研究对象。使用 Affymetrix 公司的全基因组芯片(AffymetrixAxiom Genome-Wide CHB I ArrayPlate) 由上海交通大学BIO-X中心检测。获得1515例冠心病患者和5019例正常人全基因组芯片SNP的基因型数据。通过全基因组关联(GWAS)统计分析计算获得SNP芯片中每个位点与冠心病关联显著性水平(P值)，按照显著性水平(P值小于0. 001)找出与冠心病之间存在潜在关联的染色体区域，并得到冠心病易感性显著关联的单核苷酸多态性位点及其等位基因。统计分析时采用plink软件进行logistic回归分析评估每个SNP位点与冠心病关联的显著性，计算危险等位基因的相对危险度(Odds ratio, OR)和95%的可信区间，分析中直接获得OR值、可信区间和P值，从而得到所述位点的危险等位基因。二、病例和对照样本入选标准冠心病病例包括心肌梗死患者和心绞痛患者，心肌梗死病例的入选诊断标准为急性心肌梗塞诊断标准(根据WHO 1979年的诊断标准):即典型胸痛症状持续30分钟以上；心电图连续2个导联ST段抬高(肢体导联0. Imv,胸导联0. 2mv)并有系列动态变化；心肌坏死的血清标记物浓度升高，如肌钙蛋白(TNT/TNI)升高，心肌同工酶(CK-MB)升高大于正常值高限的2倍。心绞痛病例的入选诊断标准为经冠脉造影发现冠状动脉至少一个主要分支狭窄超过70%。经各项检查除外心脏瓣膜疾病、先天性心脏病、心力衰竭、严重的肾脏及肝脏疾病、继发性高血压、心肌病、家族性高胆固醇血症及可疑冠心病患者。对照组入选标准既往无冠心病或其他动脉粥样硬化病史，无胸痛、胸闷等心脏病症状，心电图无明显缺血性改变。病例组和对照组均为中国汉族人，且无血缘关系。三、测试人群的基本特征测试人群为芯片检测样本其基本特征如表I所示表I :
权利要求
1.与冠心病易感性显著关联的易感区域chr5pl5的单核苷酸多态性位点，所述单核苷酸多态性位点是位于染色体5pl5上的TRIO基因区域的一段紧密连锁区域内的一系列单核苷酸多态性SNP位点，为:rsl 17297784，等位基因为A/G ;为:rsl058312，等位基因为A/G ；为rs9942367，等位基因为A/T ;为rsl7500919，等位基因为C/T ;为rslll33787，等位基因为C/To
2.根据权利要求I所述的单核苷酸多态性位点，其中所述的一系列SNP位点的危险等位基因分别是rsl 17297784多态性位点为G，rsl058312多态性位点为A，rs9942367多态性位点为T，rsl7500919多态性位点为T，rsl1133787多态性位点为T。
3.根据权利要求I或2所述的单核苷酸多态性位点，其中与冠心病易感性关联最显著的代表性单核苷酸多态性位点是rsl 17297784。
4.根据权利要求I或2所述的单核苷酸多态性位点用于评估冠心病易感性的用途，其特征在于，所述冠心病包括心肌梗死和心绞痛。
全文摘要
本发明公开了与疾病易感性相关联的单核苷酸多态性位点，特别涉及一种与冠心病易感性关联的易感区域chr5p15的单核苷酸多态性位点及其在评估冠心病易感性中的应用，属于生物技术领域。所述单核苷酸多态性位点是位于染色体5p15上的TRIO基因区域的一段紧密连锁区域内的一系列单核苷酸多态性SNP位点，为rs117297784，rs1058312，rs9942367，rs17500919和rs11133787。根据本发明染色体5p15由TRIO基因区域的SNP位点以及由一系列SNP位点组成的单体型的变异特性判断冠心病易感人群的方法，可以对未出现冠心病早期临床症状的人群，尤其具有传统危险因素的冠心病高危人群，进行无创快速简便的筛查，早期发现冠心病易感对象，并采取相应的保健措施，降低冠心病与心肌梗死的发病率。
文档编号C12Q1/68GK102747072SQ20121018655
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者李宏帆, 王来元, 郝永臣, 陈恕凤, 顾东风, 鲁向锋 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院