专利名称：旱稻孢囊线虫特异性rapd和scar标记快速分子检测方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及旱稻孢囊线虫特异性RAPD标记全序列、特异性SCAR标记引物序列及旱稻孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法。
背景技术：
旱稻抱囊线虫(Heteroderaelachista Ohshima, 1974),最早发现于日本的枥木县山地稻田中(Ohshima, 1974)，广泛分布于日本的东北地区和九州地区，主要侵染水稻，目前在伊朗和中国也有分布。该病害引起的产量损失范围在 7%-19%(Bridgeet ,Nematode parasites ofrice, Plant parasitic nematodes m tropical andsubtropical agriculture. Wallingford, UKj CABI Publishing, 1990，69-108)。ニ龄幼虫在五月中旬侵染旱稻根部，卵在五周后开始沉积，孢囊在6-8周后开始形成(ShimizuK. seasonal iluctuation and rhizospherical distribution of population oi theupland rice cyst nematode, Heterodera elachista. Japanese Journal of Nematology1977，7:49-57)。丁中(贺沛成，洪宏，伍敏敏，丁中·旱稻孢囊线虫(Heteroderaelachista)孵化特性研究.植物保护，2011，37 (6) : 101-103)研究发现，旱稻孢囊线虫适宜的孵化温度是28-32°C，与玉米孢囊线虫类似，最佳孵化温度均为30°C左右(Hashmib, Krusoerg LR. Factors miluencmg emergence of juveniles from cysts oiHeterodera zera. Journal of Nematology. 1995, 27 (3) : 362-369)。在我国，目前旱稻抱囊线虫仅在湖南湖北部分地区有报道。旱稻孢囊线虫属于Cyperi群组，在形态上与H. oryzae, H. sacchari和
H.Ieuceilyma非常相近。其与H. sacchari和H. Ieuceilyma最明显的区别是在孢囊细长的下桥上缺乏指形的投影，而与H. oryzae相比，孢囊略小，ニ龄幼虫长度略短。目前旱稻孢囊线虫的鉴定大部分仍然依赖于传统的形态学鉴定方法，但是由于形态学鉴定耗时、需要很熟练的技术作为基础，并且需要专门从事分类的人员来完成，这些原因使传统的鉴定方法时常存在一定误差并且不适用于大規模的样品检測。为了弥补形态学鉴定的不足，快速、准确的对农作物孢囊线虫进行鉴定和检测，分子检测技术迅速发展。20世纪80年代后期发展成功的DNA多聚酶链式反应(PCR)，使得直接扩增DNA成为可能，在此基础上还产生了各种新的分子标记技术，这些分子标记和检测技术都成功的应用到植物寄生线虫特别是农作物孢囊线虫的分类鉴定和检测过程中。特异性引物PCR或多重PCR技术是近年来线虫分子诊断取得的重要进展。通过一次PCR测验就可以在混合样品中特异性地检测出ー个或多个线虫种。例如Subbotin SA, Peng D L 等(Subboton S A, Peng D L, Moens M. A rapid method for theidentmcation of the soybean cyst nematoae Heterodera glycines using duplexPCR. Nematology 2001, vol. 3 (4) :365-371)运用双重PCR检测大豆孢囊线虫的方法，在一个PCR反应体系中同时运用通用引物D3A和D3B以及特异性引物GlyFl和rDNA2，从52个大豆孢囊线虫群体中均扩增出两个DNA片断(181bp and345bp),检测的敏感度高达单个孢囊、单头ニ龄幼虫的微量DNA。此外，PCR技术对其他植物寄生线虫种类的检测也有较多进展。近年来，基于PCR技术的各种分子标记迅速发展起来，各种分子标记检测技术特异性更高，检测更准确，在植物寄生线虫的分子检测中应用也越来越广泛。1990年，Williams 等和 Welsh 等(Welsh Jj MeClelland M. Fingerprinting genomes using PCRwith arbitrary primers. Nuc IicAcids Research·，1990，18:7213-7218)两个研究小组几乎同时发现了一种新的分子标记一RAPD标记(Random Amplified Polymorphism DNA)。RAPD引物为随机的寡聚核苷酸，长度多为10个核苷酸左右，通过PCR反应扩增基因组DNA，从而产生不连续的DNA产物，结合琼脂糖凝胶电泳也可以获得不同的图谱。由于不同基因组DNA序列碱基位点具有明显的差异，在不同区段上可与引物发生结合的位点也不尽相同，因此扩增条带的大小数量等特征也不同，从而使不同的种表现出多态性。RAH)优点是所需DNA量极少，要求设备也相对简单，但是由于RAPD引物非常短，只有十个碱基，退火温度也较低，如果PCR体系变化，或者仪器变化，重复性会变差，而且易产生非特异性的条带。为了弥补这ー不足，可以将其转为SCAR (sequence characterized amplifiedregion)标记。RAPD转化的SCAR标记技术由Paran和Michelmore于1993年提出并应用(Paran I，Michelmore R W. Development ofreliabie PCR-based markers linkedto downy mildew risistence genes in lettuce, meoretical and Applied genetics1993,85:985-993.)。Edward P. Caswe 11 -Chen 等(Edward P，Caswell-Chenj ValerieMj Williamson, FrancesF. Wu. Random amplified polymorphic DNA analysis ofHeterodera cruciferae and H. schachtiI populations. Journal of Nematology1992，24(3) :343-351)运用 RAH)标记区分了 H. cruciferae 和 H. schachtii，用 10 个不同的随机引物扩增燕麦孢囊线虫的不同种群的DNA，产生了 78条清晰的谱带。1995年Lopez-Braiia I 等对禾谷孢囊线虫群体做了 RAPD 分析。Jianbo Li (Jianbo Li，JamalFaghhihij John M. Ferris, et al. The use of RAPD amplified DNA as markers forvirulence characteristics in soybean syst menatode. Fundamental And AppliedNematology 1996，19(2) : 143-150)等用RAPD标记技术研究了大豆抗性品种与大豆孢囊线虫的致病型之间的关系。Blok V. C. (Blok V Cj Philips, Harrower BE. Comparison ofBritish populations of potato cyst nematodes with populations irom continentalEurope and south America using RAPDs. Genome 1997，40:286-293)等通过 RAPD 技术研究马铃薯金线虫和马铃薯白线虫两个群体的线虫致病型之间的遗传关系。在RAPD标记与SCAR标记的联合应用方面，Meng Qing-peng等(MengQmgpengj Long H, Xu J H. PCR assays ior rapid and sensitive identificationof three major root-knot nematodes,Meloidogyne incognita,M. javanica andM. arenaria. Acta Phytopathologica Sinica2004，34 (3) : 204-210)成功地将南方根结线虫和爪哇根结线虫特异的随机扩增多态性DNA片段转化为SCAR标记。Adam M. A. M.等(Adam M A M，Phillips M S，Blok V C. Molecular diagnostic key for identificationof single juveniles of seven common and economically important species ofroot-knot nematode(Meloidogyne spp·)·Plant Pathology 2007，56:190-197)运用SCAR标记技术区分了根结线虫属的七种线虫。在马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的快速分子诊断中，Fullanodo, A. et. Al (Fullaondo A, Barrena E, Viribay M, Barrena丄，balazar A, Ritter Ε·丄dentification of potato cyst nematode species Gioooderarostocniensis and G. pallida by PCR using specific primer combinations.Nematology 1999，1:157-163)用随机引物0PG5分别扩增出区分马铃薯金线虫和马铃薯白线虫特异性RAPD标记片段，将RAPD标记转化成SCAR标记后，分别扩增出了315bp 和 798bp 的特异性片段。Ou, S. Q.，Peng D. L. (Ou S Q, Peng D L, Li Y, MoensM. Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplifiedregion (SCAR) primers. Nematology 2008, 10(3) : 397-403)米用 RAPD 技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，构建的特异性SCAR标记引物扩增出500bp大豆孢囊线虫的特异性SCAR片段，选用核糖体引物D2A和D3B作为内标与上述特异性引物SCNFl和SCNRl相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫，在PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了 500bp的特异性SCAR标记片段和SOObp片段。国内外虽然有关于旱稻孢囊线虫核糖体DNA的ITS区域的研究报道，但国内外尚未见基于基因组DNA的旱稻孢囊线虫RAPD和SCAR标记特异性分子检测旱稻孢囊线虫的报道。
发明内容
针对上述技术领域的空白，本发明提供旱稻孢囊线虫特异性RAro标记的全长序列，同时将RAro标记转化为更加稳定的SCAR标记，提供了特异性SCAR标记的特异性引物。本发明还提供旱稻孢囊线虫特异性SACR快速分子检测方法，为制定线虫的快速分子检测、旱稻孢囊线虫病的早期诊断和制定线虫病害综合治理对策服务。旱稻孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。根据旱稻孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段的保守序列设计的特异性引物。特异性引物为HeFl和HeRl，其序列为HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3，，HeRl : 5 ’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3，。旱稻孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有上述特异性引物。所述PCR反应体系中含有特异性引物HeFl和HeRl。所述PCR反应体系为反应体系总体积为25μ1，其中含有2. 5μ I IOXPCRBuffer (含 Mg++);2. Ομ I dNTP ；1. Ομ I HeFl (0· I μ g/μ I); I. 0 μ I HeRl (O. I μ g/μ I)；O. 25 μ ITaq DNA 聚合酶(5U/μ I) ；1. Ομ I 模板 DNA ;ddH20 补足 25 μ I。其中PCR 扩增程序为94°C 预变性 5min，然后 94°C 30S, 54°C 30S, 72°C Imin 循环35次，72°C延伸lOmin，保存在4°C条件下。本发明利用RAPD技木，获得了基于旱稻孢囊线虫基因组DNA的特异性RAPD标记，经克隆测序后，设计SCAR标记引物，将RAPD标记转换成SCAR标记，利用该SCAR标记的特 异性引物，可检测出目标线虫。本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物HeFl和HeRl(即SEQ ID N02和SEQID N03)。利用旱稻孢囊线虫特异性引物HeFl和HeRl，在PCR扩增条件下，所有旱稻孢囊线虫群体都获得了 434bp的特异性SCAR标记片段，而其它线虫类则没有434bp的特异性SCAR标记片段。本发明构建的特异性引物HeFl和HeRl，特异性强，准确，灵敏。本发明应用特异性SCAR标记PCR检测技术检测目标线虫，与重复性较差的RAPD技术(RAPD-PCR),核糖体DNA限制性内切酶技术(RFLP-PCR)检测方法相比，更能够省时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的旱稻孢囊线虫检测技木。该技术可应用于对旱稻孢囊线虫田间土壤样品及旱稻孢囊线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。
图I :用12个Operon系列的含10个碱基的随机引物对旱稻孢囊线虫HeOl进行 扩增。M 为标准 DNA 分子标记(DNAmarker DL 2，000) ;1_12 为随机引物 OPAtl2, OPA03, OPA
06,OPA09, OPA13, OPB15, OPC06, OPD13, OPG06, OPG08, OPG10, OPK16; 13 为阴性对照。(代码见表 I 和表2)图2 :用随机引物OPB15扩增旱稻孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、大麦孢囊线虫、马铃薯腐烂茎线虫等的RAPD的特异性DNA片段結果，M 为标准 DNA 分子标记(DNAmarker DL 2，000)；l-5:He01, He02, He03, He04, He05;6-16:HfOl, Hf06, HaOI, Ha06, HalO, HgOI, Hg03, HgoOI, Hgo05, RsOl, DdOl; 17 :阴性对照。(代码见表I)图3 :用旱稻孢囊线虫特异性SCAR标记引物(HeFl和HeRl)扩增5种孢囊线虫和2种非孢囊线虫的結果，M 为标准 DNA 分子标记(DNA marker DL 2，000);l_5:He01，He02, He03, He04, He05;6-15:Ha01, Ha06, HalO, HfOI, Hf06, HgOI, Hg03, HgoOI, RsOl, DdOl; 16 :阴性对照。(代码见表I)
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步的详细说明。本发明的实验选用的材料供试线虫包括19个禾谷孢囊线虫群体，11个菲利普孢囊线虫群体，3个大豆孢囊线虫群体，12个豌豆孢囊线虫群体，5个旱稻孢囊线虫群体，I个大麦孢囊线虫群体，I个松材线虫群体，I个马铃薯腐烂茎线虫群体，I个香蕉穿孔线虫群体，共计54个线虫群体。其中17个小麦禾谷孢囊线虫群体为本实验室长期从山东省、青海省、河南省、甘肃省、北京等地收集保存且繁殖在小麦上的孢囊线虫种群，9个菲利普孢囊线虫群体为本实验室从河南等省市收集保存，2个小麦禾谷孢囊线虫国外群体，2个菲利普孢囊线虫国外群体以及其他线虫群体为本实验室工作人员收集。如表I所示。下述供试线虫样品可以对外公开发放。表I供试线虫样品代码及群体来源
权利要求
1.旱稻孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.根据权利要求I所述的旱稻孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段的保守序列设计的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的特异性引物为HeFl和HeRl，其序列为HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3’，HeRl :5’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3>
4.旱稻孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有权利要求I或2所述的特异性引物。
5.根据权利要求4所述的检测方法，所述PCR反应体系中含有特异性引物HeFl和HeRl,其序列为HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3’，HeRl :5’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3>
6.根据权利要求5所述的检测方法，所述PCR反应体系总体积为25μ 1，其中2. 5μ I10 X PCR 含 Mg2+的 Buffer ；2. 0μ I dNTP ；1. 0μ I 浓度为 0. I μ g/ μ I 的 HeFl, ;1. O μ I 浓度为 O. I μ g/ μ I 的 HeRl ；0. 25 μ I 浓度为 5U/ μ I 的 Taq DNA 聚合酶；I. O μ I 模板 DNA ；ddH20补足25 μ I。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其中PCR扩增程序为94°C预变性5min，然后940C 30S，54°C 30S，72°C Imin 循环 35 次，72°C延伸 lOmin，保存在 4°C条件下。
全文摘要
本发明涉及旱稻孢囊线虫特异性RAPD和SCAR标记快速分子检测方法，属生物技术领域。旱稻孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段，具其如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。根据旱稻孢囊线虫特异性RAPD扩增片段，设计特异性引物HeF1和HeR1，将其转化为更加稳定的SCAR标记片段，在SCAR标记快速分子检测旱稻孢囊线虫的方法中，可扩增出434bp的特异性片段。本发明提高了分子检测灵敏度并且快速准确，在旱稻孢囊线虫检测以及旱稻孢囊线虫病的早期诊断方面，具有很高的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102690824SQ201210200140
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者丁中, 亓晓莉, 彭德良, 彭焕, 贺文婷, 黄文坤 申请人:中国农业科学院植物保护研究所