专利名称：肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及肠出血性大肠杆菌0157:H7多价融合型重组菌、重组蛋白制备方法及亚单位疫苗，属于生物制药领域。背景技术：
肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是重要的食源性人兽共患病原，0157:H7是其重要的血清型。近20余年来，EHEC 0157:H7引发的食物中毒在世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC 0157 :H7感染患者和无症状携带者可作为传染源。在动物宿主范围非常广泛，其中反刍动物带菌率较高。相对来讲，动物作为传 染源要比人类更为重要，它往往是动物源食品污染的根源。人类感染可引起严重的胃肠道和循环系统疾病，如出血性结肠炎(hemorrhagicColitis, HC)、溶血尿毒综合征(Haemolytic uraemic syndrome, HUS)等,个别患者可因急性和慢性肾功能衰竭而死亡。动物感染一般不引发明显的临床症状，但能够长期甚至终生携带。EHEC动物宿主范围非常广泛，其中反刍动物带菌率较高。因此，防控EHEC 0157:H7的重中之重是减少和控制动物带菌和排菌。目前，对0157:H7的感染缺乏有效的防治方法，只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗。由于0157:H7的暴发流行特点和治疗上的困难，疫苗研究就显得极为紧迫。有效的疫苗研制是预防和治疗0157:H7感染最简单、经济和快捷的手段。选取与EHEC 0157:H7粘附和定植密切相关的鞭毛(H7)、菌毛(HCP)和紧密素(Intimin)和转位紧密素受体(Tir)四个基因分别设计特异性引物对，扩增相应基因片段，并依次串联，构建重组菌，获得重组蛋白，制备亚单位疫苗，用于预防EHEC 0157:H7在动物体内的定植。三、发现内容
技术问题本发明目的在于构建EHEC 0157:H7多价融合型重组菌，表达重组蛋白，进而研制亚单位疫苗。本发明在抗原选择上直接针对EHEC 0157:H7重要的粘附因子，强调多个粘附因子的联合应用以产生最大的免疫保护作用，降低动物带菌率，进而减少人类感染EHEC的机会，保障人类身心健康。技术方案本发明的具体实施方案如下
肠出血性大肠杆菌0157:H7 (EHEC 0157:H7)多价融合型重组菌、重组蛋白制备方法及亚单位疫苗，其特征在于，所说的多价重组菌和重组蛋白为BL21(pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。多价重组菌和重组蛋白的制备方法包括
(I)肠出血性大肠杆菌0157:H7免疫多价融合型重组菌，其构建方法为
根据GenBank中0157:H7 EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点(下划线部分)，在AcW基因后和me基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下
fliC~ I 5-ggggagctcactattaccaacaaa~3Sac IfHC~V2 5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3Xhol I
AcpA-Pl 5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3Xhol I
hcpA~ 2 5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR Itir~ l 5-gatgaattcgagccggatagccca-3EcoR I
tir~ 2 5~ttagtcgacagcccccgatgaaac~3Sal I
eae~V\ 5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc~3 Sal I eae~ 2 :5_ ggctctagattattctacacaaaccgc-3Xba I
0157 :H7过夜培养物，ImL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮10min，4°C 12000r离心10分钟，吸取上清冻存_20°C，用于PCR扩增用；
扩增片段的上下游引物分别加有fee I和通I酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有免7 1和油<3 I酶切位点，PCR反应条件均为95°C预变性5分钟，94°CI分钟，55°C 30秒，72 0C I分钟，30个循环，72°C再延伸10分钟；
扩增AcW片段的上下游分别引物加有通I和及I酶切位点，扩增Kr片段的上下游引物分别加有I和I酶切位点，PCR反应条件均为95°C预变性5分钟，94°CI分钟，56 V 30秒，72 °C 30秒，30个循环，72 °C再延伸6分钟。fIiC-VI 和 fIiC-Vl、hcpA-PI 和 IwpA-P2、tir~ I 和 h>_P2、eae_PI 和 eae_P2 扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和81 Ibp。将扩增的PCR产物用质量比I. 2%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液后65°C作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0. 5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心I分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I 500uL, 12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II 750uL, 12000g离心I分钟，弃液体，空管12000g离心I分钟，转移柱子于干净的I. 5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液,12000g离心I分钟,收集离心液,即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段。将fee I和沿07 I酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pCold I片段4uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. OuL，同时加入一个离心管，混匀后，4°C连接过夜，用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用5^ I和通W I双酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到一条fliC片段大小的条带出现，获得pCold I重组质粒；用ZAo 1和&0/ I酶切hcpA片段和pCold I -f IiC重组质粒，胶回收后，PCold I取4. OuL，hcpA片段取2 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. Oul,补水2 uL, —同加入eppendorf管，混勻后,4°C连接过夜,转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现,获得pCold I -fliC-hcpA重组质粒；用AcoTP I
Sal I 酶切 tir 片段和 pCold I -fliC-hcpA 重组质粒,胶回收后，pCold I -fliC-hcpA取2. OuL, tir片段取3. 0 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. Oul，补水3 uL，一同加入离心管中，4°C连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带 出现，获得pCold I -fliC-hcpA-tir重组质粒；用5^7 I和ZAa I酶切eae片段和pCold I -fliC-hcpA-tir 重组质粒,胶回收后,pCold I -fliC-hcpA-tir和eae各取4. OuL,T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. Oul，一同加入管中，混匀后，4°C连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现,获得pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒PCold I -fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21 (DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。(2)多价重组菌的构建、多价重组融合蛋白的表达和纯化
将BL21 (pCold I -f liC-hcpA-tir-eae)培养物按体积比2%接种于含lOOPg/mL有氨苄抗生素的LB中，37°C振荡培养至A=O. 6^0. 8时加入诱导剂IPTG至工作浓度为0. 5mM,继续15°C震荡培养24小时，诱导菌液离心收集菌体重悬于TE缓冲液中，超声裂解后，12000g离心25分钟，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小为88kD目的蛋白，主要存在于菌体上清中，获得fliC-hcpA-tir-eae多价重组蛋白。将上述诱导重组菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)经 12000 g 离心 10 分钟，收集菌体，用1/10体积的螯合缓冲液重悬，再加入lmg/mL的溶菌酶，混匀后30°C作用2小时，超声波进行超声破碎，4°C 12000 g离心30分钟收集上清，0.45剛滤器过滤后上经过预处理(4倍柱体积的螯合缓冲液洗柱子)的Ni+亲和层析柱，加入洗脱缓冲液收集蛋白，即为经过纯化的fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。(3) EHEC 0157:H7多价融合蛋白亚单位疫苗的制备
将上述纯化的多价融合蛋白测定蛋白浓度，控制在0.2呢/叱。抗原与佐剂(ISA50V，法国S印pic公司生产)按照1:1 (V/V)进行分散处理制成油乳剂。有益效果本发明的特点和优点如下
I、本发明针对EHEC 0157:H7重要的粘附因子串联构建了融合型重组菌。利用PCR,获得fliC、hcpA、tir和eae四个基因片段，并通过串联，最终克隆入表达质粒pCold中，成功构建pCold I -fliC-hcpA-tir-eae,转化入BL21中获得重组菌，即BL21(pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。2、本发明成功获得 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)，经过 37°C高密度发酵培养，15°C IPTG的诱导获得高效表达，表达量约占全菌蛋白的30%，经过纯化后获得重组融合型蛋白，即fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。3、本发明将纯化后的fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白制备了亚单位疫苗，免疫了Balb/c小鼠和山羊，明确了上述表达的重组蛋白具有良好的免疫原性，为更加安全而有效的防控肠出血性大肠杆菌的感染和致病提供了有效的技术方法。四
图I :pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重组质粒酶切鉴定。M, DL-2000 ; 1-3, pCold I -fliC-hcpA-tir-eae 重组质粒质粒 fee I /Xba I图 2 :BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)重组菌电泳分析。M,中分子量蛋白质 Marker ；1, BL21 (pCold I -f I iC-hcpA-t ir~eae)诱导后全菌蛋白；2, BL21 (pCold I -fIiC-hcpA-tir-eae)诱导前全菌蛋白；3, BL21(pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)诱导后全菌蛋白上清
图3 :免疫后小鼠血清中IgG滴度测定 图4 :免疫组和对照组小鼠攻击排菌变化 图5 :免疫后山羊粪便中IgG滴度测定图6 :免疫组和对照组山羊攻击排菌变化
五具体实施例方式 I、获取fliC、hcpA、tir和eae基因，并串联克隆入pCold I载体根据GenBank中0157:H7 EDL933 (上海三踏生物科技有限公司)的(序列号L07388)、AcW (序列号NC_013008)、(ir (序列号AF125993)和 eae (序列号Z11541)基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点(下划线部分)，在AcW基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下fliC~ I 5-ggggagctcactattaccaacaaa~3Sac I
fIiC-V2 5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3Xhol I
AcpA-Pl 5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3Xhol I
hcpA~ 2 5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR Itir~ l 5-gatgaattcgagccggatagccca-3EcoR I
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eae~V\ 5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc~3 Sal Ieae~ 2 :5_ ggctctagattattctacacaaaccgc-3Xba I
0157 :H7过夜培养物，ImL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮10min，4°C 12000r离心10分钟，吸取上清冻存_20°C，用于PCR扩增用；
扩增片段的上下游引物分别加有fee I和通I酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有免7 1和油<3 I酶切位点，PCR反应条件均为95°C预变性5分钟，94°CI分钟，55°C 30秒，720C I分钟，30个循环，72°C再延伸10分钟;扩增Acpd片段的上下游分别引物加有通I和及^7 I酶切位点，扩增(ir片段的上下游引物分别加有及^7 I和Sal I酶切位点，PCR反应条件均为95°C预变性5分钟，94°C I分钟，56°C 30秒，72°C 30秒，30个循环，72 °C再延伸6分钟。fIiC-VI 和 fIiC-Vl、hcpA-PI 和 IwpA-P2、tir~ I 和 h>_P2、eae_PI 和 eae_P2 扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和811bp。将扩增的PCR产物用质量比I. 2%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液(天根公司)后65°C作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0. 5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子(天根公司)，并12000g离心I分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I 500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II 750uL, 12000g离心I分钟，弃液体，空管12000g离心I分钟，转移柱子于干净的I. 5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液，12000g离心I分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段。将fee I和沿o7 I酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pCold I (大连宝生物公司)片段4uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. OuL，同时加入一个离心管，混匀后，4°C连接过夜，用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用5^ I和通I双酶切，37 °C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到fliC片段大小的条带出现，获得pCold I重组质粒；用沿o I和及I酶切hcpA片段和pCold I -fliC重组质粒，胶回收后，pCold I取4. OuL, hcpA片段取2 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. Oul，补水2 uL，一同加入印pendorf管，混匀后，4°C连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pCold I -fliC-hcpA 重组质粒；用 I 和 5^7 I 酶切 tir 片段和 pCold I -fliC-hcpA重组质粒，胶回收后，pCold I -fliC-hcpA取2. OuL，tir片段取3.0 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. Oul，补水3 uL，一同加入离心管中，4 °C连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现,获得pCold I -fliC-hcpA-tir重组质粒；用5^7 I和油<3 I酶切eae片段和pCold I -fliC-hcpA-tir重组质粒，胶回收后，pCold I -fliC-hcpA-tir 和 eae 各取 4. 0uL，T4 DNA 连接缓冲液和 T4 DNA连接酶各 I. Oul，一同加入管中，混匀后，4°C连接过夜，转化ToplO (南京百思凯)感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段 大小的条带出现，获得pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pCold I -fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21 (DE3)(南京百思凯)感受态细胞中，获得多价重组菌 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)。2、多价重组菌的构建、多价重组融合蛋白的表达和纯化
将 BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)培养物按体积比 2% 接种于含 lOOPg/mL 有氨苄抗生素的LB培养基(蛋白胨10g/L ;酵母提取物5g/L ;氯化钠5g/L)中，37°C振荡培养至A=O. 6 0. 8时加入诱导剂IPTG至工作浓度为0. 6mM，继续15°C震荡培养24小时，诱导菌液离心收集菌体重悬于TE缓冲液中，超声裂解后，12000g离心25分钟，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小为88kD目的蛋白，主要存在于菌体上清中，获得fliC-hcpA-tir-eae多价重组蛋白。将上述诱导重组菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)经 12000 g 离心 10分钟，收集菌体，用1/10体积的螯合缓冲液重悬，再加入lmg/mL的溶菌酶，混匀后30°C作用2小时，超声波进行超声破碎，4°C 12000 g离心30分钟收集上清，0. 45剛滤器过滤后，加入到Ni+亲和层析柱(上海英俊公司)，加入洗脱缓冲液收集蛋白，即为经过纯化的fliC-hcpA-tir-eae 重组蛋白。3, EHEC 0157:H7多价融合蛋白亚单位疫苗的制备
将上述纯化的多价融合蛋白测定蛋白浓度，控制在0. 2Pg/ML。抗原与佐剂ISA50V(法国Seppic公司生产)按照1:1 (V/V)进行分散处理制成油乳剂。4、免疫试验 (一)小鼠试验
(I)实验动物选取雄性BALB/c小鼠(扬州大学购买)20只，18g-22g/只。(2)实验动物的前处理在攻毒前所有组均给予5g/L链霉素溶液饮用3天，3天后粪检肠道排菌少于IO3 CFU/g，灌胃攻菌后全部给予0.5g/L的链霉素溶液饮用。以排除肠道正常菌群，为0157:H7在小鼠体内驯化一个定居和生长的环境，在肠道中成为优势菌群，增加小鼠的易感性。并在攻毒前断水断食12小时，攻毒后6小时恢复饮水饮食，防止攻毒后细菌快速排出动物肠道，延长在其体内作用时间。(3)免疫攻毒和分组情况将20只小鼠随机分为2组，每组10只，即实验组应用制备的亚单位疫苗，而对照组用等量的无菌磷酸盐缓冲液替代。采用背部及腹部皮下多点注射方式进行免疫，免疫I次，免疫剂量为25ug/只。免疫后35天后进行灌胃攻毒，剂量约为I X 101° CFU/只。攻菌后密切观察各组小鼠的行为、摄食情况及精神状态的变化，详细统计各组小鼠死亡情况，并每隔两天收集小鼠新鲜粪便，测定粪便中排菌时间和排菌量的变化情况。(4)免疫后血清中fliC-hcpA-tir-eae特异性IgG抗体的检测 小鼠免疫前后，对小鼠采取断尾方式采血制备血清，应用间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清IgG抗体效价。(5)免疫效果确定依据
①抗体变化利用ELISA检测免疫后血清抗体变化，以重组抗原包被酶标板，结果表明能够诱导高滴度的IgG，达到3.89X 105以上，并且一致性良好。图3。②攻毒保护情况35天攻毒，结果显示免疫组小鼠存活率为10/10，对照组存活率为6/10。③排菌量变化攻毒后24小时开始采集粪便，之后每隔两天采集一次，经过适当处理后涂布筛选性麦康凯平板，37°C培养18 24小时，取出平板计数，并对菌落用二重PCR进行鉴定，均为0157:H7。免疫组排菌时间缩短，免疫组攻毒之后第4天检测不到0157:H7，而对照组于第14天仍能检测到高达IO4CFU以上的排菌，图4。(二)山羊试验
(I)实验动物选取雄性山羊(江苏省农业科学院羊场购买)10只，3月龄。(2)实验动物的前处理在攻毒前所有山羊断食断水12小时，攻毒后6小时恢复饮水饮食，防止攻击后细菌快速排出动物肠道，延长在其体内作用时间。(3)免疫攻毒和分组情况将10只山羊随机分为2组，5只/组。颈部多点注射免疫，免疫剂量为200ug/只。间隔21天后,进行2次免疫,二次免疫后14天后进行灌胃攻毒，剂量约为IXlOici CFU/只。攻菌后密切观察各组羊的行为，并每隔2天收集山羊的新鲜粪便，测定粪便中排菌时间和排菌量的变化情况。(4)免疫后血清中fliC-hcpA-tir-eae特异性IgG抗体的检测
山羊免疫前和二免后，耳静脉采血制备血清，应用间接ELISA方法检测免疫后血清IgG抗体效价。(5)免疫效果确定依据
①抗体变化利用ELISA检测免疫后血清抗体变化，以重组抗原包被酶标板，结果表明能够诱导高滴度的IgG，达到2. 48 X IO4以上。图5。②攻毒保护情况对照山羊和免疫山羊没有任何不良反应，无死亡。③排菌量变化攻毒后24小时开始采集粪便，之后每2天采集一次，经过适当处理后涂布筛选性麦康凯平板，37°C培养18 24小时，取出平板计数，并对菌落用二重PCR进行鉴定，均为0157:H7。免疫山羊不排菌，而对照山羊第12天仍然在排菌。图6。
权利要求
1.肠出血性大肠杆菌0157:H7多价融合型重组菌，其构建方法为 根据GenBank中0157 :H7 EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点，在AcW基因后和咖基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下 fliC~ I 5-ggggagctcactattaccaacaaa~3Sac I fHC~V2 5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3Xhol I AcpA-Pl 5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3Xhol IhcpA~ 2 5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3 EcoR Itir~ l 5-gatgaattcgagccggatagccca-3EcoR I tir~ 2 5~ttagtcgacagcccccgatgaaac~3Sal I eae~V\ 5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc~3 Sal I eae~ 2 :5_ ggctctagattattctacacaaaccgc-3Xba I 0157:H7过夜培养物，ImL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮10min，4°C 12000r离心10分钟，吸取上清冻存_20°C，用于PCR扩增用； 扩增片段的上下游引物分别加有fee I和通I酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有免7 1和油<3 I酶切位点，PCR反应条件均为95°C预变性5分钟，94°CI分钟，550C 30秒，720C I分钟，30个循环，72°C再延伸10分钟;扩增Acpd片段的上下游分别引物加有通I和及^7 I酶切位点，扩增(ir片段的上下游引物分别加有及^7 I和Sal I酶切位点，PCR反应条件均为95°C预变性5分钟，94°C I分钟，56°C 30秒，72°C 30秒，30个循环，72°C再延伸6分钟； fIiC- I 和 fliC-V2、hcpA-V\ 和 Ac/^_P2、tir~ l 和 tir_ 2、eae~ l 和 eae_P2 扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和81 Ibp ; 将扩增的PCR产物用质量比I. 2%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液后65°C作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0.5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后,将融化的液体转移于微型柱子,并12000g离心I分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I 500uL, 12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II 750uL, 12000g离心I分钟，弃液体，空管12000g离心I分钟，转移柱子于干净的I. 5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液,12000g离心I分钟,收集离心液,即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段； 将5^ I和通I酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pCold I片段4uL，T4DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. OuL，同时加入一个离心管，混匀后，4°C连接过夜，用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用5^ I和通W I双酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到fliC片段大小的条带出现，获得pCold I重组质粒；用ZAo I和&0/ I酶切hcpA片段和pCold I -fliC重组质粒，胶回收后，PCold I取4. OuL，hcpA片段取2 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. Oul,补水2 uL, —同加入eppendorf管，混勻后,4°C连接过夜,转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现,获得pCold I -fliC-hcpA重组质粒；用AcoTP ISal I 酶切 tir 片段和 pCold I -fliC-hcpA 重组质粒,胶回收后，pCold I -fliC-hcpA取2. OuL, tir片段取3. 0 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. OuL，补水3 uL，一同加入离心管中，4°C连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pCold I -fliC-hcpA-tir重组质粒；用5^7 I和ZAa I酶切eae片段和pCold I -fliC-hcpA-tir 重组质粒,胶回收后,pCold I -fliC-hcpA-tir和eae各取4. OuL,T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各I. Oul，一同加入管中，混匀后，4°C连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现,获得pCold I -fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒PCold I -fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21 (DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌 BL21 (pCold I -f liC-hcpA-tir-eae)。
2.权利要求I所述肠出血性大肠杆菌0157:H7多价融合型重组菌BL21(pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)表达的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于， 将权利要求I所述BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)培养物按体积比2%接种于含lOOPg/mL有氨苄抗生素的LB中，37°C振荡培养至A=O. 6^0. 8时加入诱导剂IPTG至工作浓度为0. 5mM，继续15°C震荡培养24小时，诱导菌液离心收集菌体重悬于TE缓冲液中，超声裂解后，12000g离心25min，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小为88kD目的蛋白，主要存在于菌体上清中，获得fliC-hcpA-tir-eae多价重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于，将权利要求3所述经过0.6mMIPTG诱导的重组菌BL21 (pCold I -fliC-hcpA-tir-eae)菌液经12000 g离心10分钟，收集菌体，用1/10体积的螯合缓冲液重悬，再加入lmg/mL的溶菌酶，混匀后30°C作用2小时，超声破碎，4°C 12000 g离心30分钟收集上清，0.45剛滤器过滤后上亲和层析柱，加入洗脱缓冲液收集蛋白，即为经过纯化的fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。
5.用权利要求I所述肠出血性大肠杆菌0157:H7多价融合型重组菌制备的疫苗。
6.用权利要求2-4之一所述重组蛋白制备的疫苗。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，将权利要求2-4之一所述重组蛋白作为抗原，与佐剂ISA50V按照体积比I: I进行分散处理制成油乳剂。
全文摘要
本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗，属于生物制药领域。分别扩增出EHECO157:H7的H7鞭毛(fliC)基因、菌毛(hcpA)基因、转位紧密素受体(tir)基因和紧密素(eae)基因，依次串联，克隆入表达载体pColdⅠ中，获得重组质粒pCold-fliC-hcpA-tir-eae，在BL21(DE3)获得高效表达。经过高密度发酵和一系列的纯化程序获得高纯度的融合蛋白分子疫苗。该疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获得目标蛋白纯度较高，动物试验证明可刺激机体在体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫方面产生高效的免疫应答，免疫预防保护和治疗作用。
文档编号C12P21/02GK102747024SQ20121020125
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者何孔旺, 俞正玉, 倪艳秀, 叶青, 吕立新, 周俊明, 张雪寒, 李彬, 栾晓婷, 温立斌, 王小敏, 茅爱华, 郭容利 申请人:江苏省农业科学院