一种利用重组大肠杆菌发酵生产l-4-羟脯氨酸的方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法，该重组大肠杆菌由如下方法构建：根据公布的脯氨酸-4-羟化酶基因和色氨酸启动子序列，先优化设计色氨酸串联启动子和脯氨酸-4-羟化酶结构基因，然后全基因合成色氨酸串联启动子基因和脯氨酸-4-羟化酶结构基因后，将启动子和结构基因连接到pAMP质粒上，构建了可过量表达脯氨酸-4-羟化酶的重组质粒pAMP-P2trp-Hyp。本发明还公开了所述大肠杆菌在生产4-羟基脯氨酸中的应用，摇瓶发酵结果表明，本发明的重组大肠杆菌的4-羟基脯氨酸的产量达到0.31g/L，提示该重组菌具有良好的工业开发前景。
【专利说明】—种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法
【技术领域】
[0001]一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法，属于微生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]轻脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)为亚氨基酸,是脯氨酸羟基化后的产物,根据其羟基化位置的不同，可分为3-羟基脯氨酸(3-Hyp)或4-羟基脯氨酸(4_Hyp)。自然界中反式-4-羟基脯氨酸较为常见，反式-4-羟脯氨酸是动物组织蛋白如胶原等的重要组成部分。4-羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。在医药方面，4-羟脯氨酸作为原料可用于合成消炎药、碳青霉烯类、血管紧张肽转化酶抑制剂。在化工合成方面，4-羟脯氨酸是合成多种聚合物的必不可少的手性原料，且发挥着重要作用。在家禽饲料中添加羟脯氨酸，可防止因甘氨酸合成不足而造成的营养不良。4-羟脯氨酸在食品营养方面也有重要作用，由于婴儿消化系统不完全，需以羟脯氨酸作为营养物质来补充甘氨酸、丙酮酸和葡萄糖。另外，4-羟脯氨酸还具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，因此许多化妆品中都添加有羟脯氨酸，以期保养皮肤和延缓衰老。
[0003]目前，合成4-羟脯氨酸的方法有化学合成法、生物提取法以及微生物酶法。生物提取法利用动物蛋白来源如明胶、猪皮为原料经酸、碱或蛋白水解酶水解后提取羟脯氨酸，该法纯化步骤长，提取率低，成本高，浪费大量原料，且废弃物污染严重，很容易被市场淘汰。而化学合成方法合成步骤较多，成本高，也不适合工业生产。随着DNA重组技术的发展以及微生物资源的发现，使得发酵法生产4-羟脯氨酸成为工业上很有前景的生产方法。
[0004]目前国内尚未有报道利用重组大肠杆菌发酵法生产4-羟基脯氨酸。
【发明内容】
[0005]针对目前生物提取法获 得L-4-羟脯氨酸成本高，污染大，提取率低的缺陷，本发明要解决的问题是提供一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法。
[0006]本发明通过将经密码子优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因连接在高效启动子上，在大肠杆菌中过量表达该羟化酶，在发酵培养基中以葡萄糖为碳源，并通过添加L-脯氨酸来获得L-4-羟脯氨酸。
[0007]本发明所述的一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌由如下方法构建:将色氨酸串联启动子P2trp和脯氨酸-4-羟化酶结构基因Hyp连接到pAMP质粒上，构建含Hyp基因的表达载体pAMP-P2trp-Hyp，将所构建的重组质粒pAMP-P2trp-Hyp转化至大肠杆菌中，得到过量表达脯氨酸_4_羟化酶基因的重组大肠杆菌。
[0008]其中，所述的Hyp结构基因来源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp)。
[0009]上述的色氨酸串联启动子来源于ptrpLl质粒(购自Stratagene, Germany)。
[0010]上述表达Hyp基因的载体为pAMP，该质粒来源于上海旭冠公司。[0011]本发明所述重组大肠杆菌的构建步骤:
[0012]I色氨酸串联启动子的优化
[0013]色氨酸串联启动子来源于ptrpLl质粒(购自Stratagene, Germany),该质粒的色氨酸启动子来源于大肠杆菌K12菌株的色氨酸操纵子，是一个适合工业生产应用的强启动子，在SD序列跟起始密码子序列之间有Cla I酶切位点，同时，色氨酸启动子的-35区上游有HindIII酶切位点，这样便于将启动子连接到其他的表达载体上，同时，利用酶切等分子操作还可以优化SD序列与起始密码子之间的距离，使得目的基因得到高效表达。由于两个色氨酸启动子串联起来可提高表达强度，因此，根据PtrpLl质粒的色氨酸启动子，通过全基因合成，合成色氨酸串联启动子。
[0014]2脯氨酸-4-羟化酶基因的优化[0015]基本方法是根据指孢囊菌(Dactylosporangium sp)的脯氨酸_4_轻化酶基因，通过优化羟化酶基因的密码子，消除一些低使用率的密码子，同时通过同义转换，优化mRNA的一级结构，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。并利用同义转化方法消除HindIILBamH IjEcoR I酶切位点。通过个基因合成，合成脯氨酸_4_羟化酶基因。
[0016]3脯氨酸-4-羟化酶基因表达载体的构建
[0017]基本方法是通过全基因合成的方法合成色氨酸串联启动子基因和优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因，然后根据设计的酶切位点，将启动子基因连接在羟化酶基因的5’端，最后，将带有色氨酸串联启动子基因的脯氨酸-4-羟化酶基因片段连接到pAMP质粒上，构建重组质粒 pAMP_p2trp_Hyp。
[0018]44-羟脯氨酸发酵重组菌株的构建
[0019]基本方法是将所构建的重组质粒pAMP-p2trp_Hyp转化至大肠杆菌中，从而获得过量表达Hyp基因的重组大肠杆菌。
[0020]本发明所述重组大肠杆菌在生产4-羟脯氨酸中的应用，其特征在于，所述应用是以所述重组大肠杆菌在补加L-脯氨酸的完全培养基中将L-脯氨酸转化为L-4-羟脯氨酸。其中，补加L-脯氨酸的完全培养基配方为:胰蛋白胨10g/L,酵母抽提物5g/L,氯化钠IOg/L，调节pH为7.0-7.2后121°C火菌15min，接种前加入L-脯氨酸(过滤除菌)至终浓度为200mMo
[0021]本发明所述重组大肠杆菌在生产4-羟脯氨酸中的应用，具体方法是:
[0022]摇瓶培养:挑取重组大肠杆菌单菌落，接种到LB液体培养基(含氨苄青霉素50 μ g/mL)中，37°C、200rpm过夜培养后，按2%接种量接入250mL摇瓶完全培养基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1% NaCl，200mML-脯氨酸，pH7.0-7.2)，在旋转式摇床中30°C、200rpm 培养 24h。
[0023]4-羟脯氨酸的定量测定:将发酵液离心后，取上清，稀释后取5ml于IOml试管中，加入2ml氯胺T(氯胺T溶液:将1.41g氯胺T溶于IOml水中，依次加入IOml正丙醇和80ml缓冲溶液，其中缓冲溶液配方为:将50g柠檬酸，26.3gNa0H和146.1g结晶乙酸钠溶于水至1L，然后与200ml水以及300ml正丙醇混合。)，摇匀后在室温中放置20min，然后加入2ml显色剂(显色剂:称取IOg对二甲氨基苯甲醒,用35ml高氯酸溶解,缓慢加入65ml异丙醇)，摇匀后迅速将试管移至60°C水浴锅中，保温20min，再用冷水冷却，室温放置30min，然后用分光光度计在560nm波长处测定吸光度。[0024]本发明所提供的利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法，具有重要的工业应用价值。
[0025]通过摇瓶发酵培养，L-4-羟脯氨酸的产量达到0.31g/L，具有较好的工业开发前
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1.重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的代谢途径。
[0027]图2.色氨酸串联启动子图谱。
[0028]图3.表达质粒的构建图谱。
【具体实施方式】
[0029]一般性说明:实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒与琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自BBI公司，操作完全按照相应说明进行。全基因合成由上海旭冠公司完成。
[0030]LB培养基(％):1%胰蛋白胨，0.5<%酵母抽提物，1%恥(:1，？!17.0-7.2。
[0031]Amp抗性平板:I % 胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1% NaCl,氨节青霉素50 μ g/ml。
[0032]SOC培养基(用于感受态细胞的复苏):2% (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母抽提物，0.05% (W/V)NaCl,2.5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM 葡萄糖。
[0033]5XKCM(大肠杆菌转化缓冲液):0.5M KCl,0.15M CaCl2,0.25M MgCL20
[0034]4-羟脯氨酸测定方法:将发酵液离心后，取上清，稀释后取5ml于IOml试管中，加入2ml氯胺T (氯胺T溶液:将1.41g氯胺T溶于IOml水中，依次加入IOml正丙醇和80ml缓冲溶液，其中缓冲溶液配方为:将50g柠檬酸，26.3gNa0H和146.1g结晶乙酸钠溶于水至1L,然后与200ml水以及300ml正丙醇混合。)，摇匀后在室温中放置20min,然后加入2ml显色剂(显色剂:称取IOg对二甲氨基苯甲醒,用35ml高氯酸溶解,缓慢加入65ml异丙醇),摇匀后迅速将试管移至60°C水浴锅中，保温20min,再用冷水冷却，室温放置30min,然后用分光光度计在560nm波长处测定吸光度。
[0035]实施例1:色氨酸串联启动子序列的设计
[0036]色氨酸串联启动子来源于ptrpLl质粒(购自Stratagene, Germany),,质粒图谱如说明书附图2，该质粒的色氨酸启动子来源于大肠杆菌K12菌株的色氨酸操纵子，是一个适合工业生产应用的强启动子，在SD序列跟起始密码子序列之间有Cla I酶切位点，同时，色氨酸启动子的-35区上游有HindIII酶切位点，这样便于将启动子连接到其他的表达载体上，由于两个色氨酸启动子串联起来可提高表达强度，因此，根据PtrpLl质粒的色氨酸启动子，通过全基因合成，合成色氨酸串联启动子。
[0037]通过优化色氨酸串联启动子，将HindIII酶切位点AAGCTT修改为EcoR I酶切位点GAATTC，同时，为了使串联启动子内部的酶切位点单一，因此将两个色氨酸启动子的结合部位的Cla I酶切位点ATCGAT修改为ATGTCGAC,使得连接处变为Sal I酶切位点，同时，在第二个色氨酸启动子序列的Cla I酶切位点后面加入一个HindIII酶切位点AAGCTT，这样可利用酶切等分子操作来优化SD序列与起始密码子之间的距离，使得目的基因得到高效表达。[0038]本实施方式中色氨酸启动子基因序列的原始序列，见SEQ ID NO:1。本实施方式中优化的色氨酸串联启动子序列提交给上海旭冠公司人工合成:优化的色氨酸串联启动子序列见 SEQ ID NO:2o
[0039]实施例2:脯氨酸-4-羟化酶基因序列的设计
[0040]根据大肠菌杆的密码子使用频率来优化基因密码子，消除低使用率的密码子，同时利用同义转化方法消除HindIII，BamH I,EcoR I酶切位点，故将原始序列中的并将终止子修改为TAAT强终止子，为了便于将脯氨酸-4-羟化酶基因连接到其他质粒载体上，因此在终止子后面插入一个酶切位点BamH I (GGATCC)。
[0041]还要考虑到mRNA的二级结构，首先要保证AUG起始密码子后及其后的几个碱基组成的密码子翻译口袋呈打开状态，降低核糖体结合到mRNA上的能势，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。
[0042]本实施方式中脯氨酸-4-轻化酶基因序列的原始序列,见Genbank Accession号D78338.1。本实施方式中优化的脯氨酸-4-羟化酶基因序列提交给上海旭冠公司人工合成；优化的脯氨酸-4-羟化酶序列见SEQ IDNO:3。
[0043]实施例3:脯氨酸-4-羟化酶基因表达载体及重组大肠杆菌的构建
[0044]先分别合成设计好的色氨酸串联启动子与脯氨酸-4-羟化酶基因，由于色氨酸串联启动子基因序列5端序列带有EcoR I (GAATTC)酶切位点，3’端有HindIII (AAGCTT)酶切位点，而脯氨酸-4-羟化酶基因5’端序列带有HindIII (AAGCTT)酶切位点，而3’端有BamHI (GGATCC)酶切位点。将色氨酸串联启动子基因序列用限制性内切酶EcoR I和HindIII双酶切，将脯氨酸-4-羟化酶基因用HindIII和BamH I双酶切，同时，将质粒载体pAMP也分别用EcoR I和BamH I消化处理。将双切酶后的色氨酸串联启动子基因序列、脯氨酸_4_羟化酶基因以及PAMP质粒载体用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后用T4 DNA连接酶将三个基因片段连接起来。连接体系为25yL:
[0045]色氨酸串联启动子基因片段:5 μ L
[0046]脯氨酸-4-羟化酶基因片段:5 μ L
[0047]PAMP 质粒:2 μ L
[0048]IOXbuffer:2.5 μ L
[0049]T4 DNA Iigase:2 μ L
[0050]16°C连接过夜后，将6μ L的连接液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，转化过程为:将6 μ L连接液加入至50 μ L的JM109感受态细胞中，然后再加入10 μ L的5 X KCM缓冲液，混匀后，在冰上放置30min后,42°C热激90s,然后在冰上放置5min后,加入500 μ L的SOC培养基，37°C, 200rpm培养60min后，涂布至Amp抗性平板上，培养12h后，提取质粒进行验证。然后进一步测序验证基因序列是否正确。从而得到了构建好的pAMP-p2trp-Hyp重组质粒，质粒图谱如说明书附图3,同时获得重组大肠杆菌JM109/pAMP-p2trp-Hyp。
[0051]实施例4:重组菌株的发酵实验
[0052]摇瓶培养:在Amp抗性平板上挑取重组大肠杆菌JM109/pAMP-p2trp_Hyp单菌落，接种到LB液体培养基(含氨苄青霉素霉素50 μ g/mL)中，37°C、200rpm过夜培养后，按2%接种量接入250mL摇瓶完全培养基(1 %胰蛋白胨，0.5 %酵母抽提物，1 % NaCl，200mM L-脯氨酸，pH7.0-7.2)，在旋转式摇床中30°C、200rpm培养24h，然后取发酵液检测4-羟脯氨酸浓度。4-羟脯氨酸的测定方法详见实施例一般性说明。发酵结果显示，重组大肠杆菌JM109/pAMP-p2trp-Hyp 的 4- 羟脯氨酸产量达到 0.31g/L。
【权利要求】
1.一株产L-4-羟脯氨酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，先优化并合成色氨酸串联启动子基因P2trp和脯氨酸-4-羟化酶结构基因Hyp，然后将色氨酸串联启动子P2trp和结构基因Hyp连接到质粒上，构建可过量表达脯氨酸_4_羟化酶的重组质粒，将重组质粒转化到宿主大肠杆菌中，得到产L-4-羟脯氨酸的重组菌。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的色氨酸串联启动子基因是来源于ptrpLl质粒,所述的脯氨酸-4-轻化酶基因来源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp)。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的表达脯氨酸-4-羟化酶结构基因的载体为PAMP质粒。
4.如权利要求1所述的构`建方法，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。
【文档编号】C12R1/19GK103509813SQ201210203625
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月20日 优先权日:2012年6月20日
【发明者】张震宇, 刘合栋, 袁春伟 申请人:江南大学