专利名称：一株耐冷玫红假裸囊菌及其在制备冷水纤维素酶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一株耐冷玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascusroseus HD1031)及其在制备冷水纤维素酶中的应用。
背景技术：
纤维素酶(cellulase)是ー种能够将纤维素降解为葡萄糖的复合酶系，主要有三个组分组成，即内切葡聚糖酶(endo-0 -I, 4-D-glucanase, EG, EC 3. 2. I. 4),也称CMC酶；外切葡聚糖酶(exo- ^ -I, 4-glucanase, EC3. 2. I. 91)或纤维ニ糖水解酶(cello-biohydrolases, CBH);葡萄糖昔酶(3-1，4-D-glucosidase，BG, EC 3.2. I. 21),也叫水杨甙酶，而且，这三种酶每ー类都会有多个同エ酶。其中，内切酶将长链纤维素从内部切断，外切酶自纤维素链的还原端或非还原端切下ニ糖或寡糖，葡萄糖苷酶将纤维ニ糖或·寡糖水解为葡萄糖。随着纤维素酶在エ业上的广泛应用，如食品、饲料、酿造、造纸，特别是在纺织エ业和生物能源上的应用，纤维素酶已经成为最近十几年酶工程研究的一个热点(中国专利 CN97199686. 5，CN201110362928. O)。到目前为止，已发现了多种能够产生纤维素酶的微生物，涵盖了厌氧与好氧、原核与真核微生物。在产生纤维素酶的微生物中，不同菌株所产纤维素酶具有不同的作用方式与底物特异性。纤维素酶根据其酶学性质与应用环境，又被分为酸性、中性与碱性纤维素酶。其中酸性纤维素酶主要用于生物能源、纺织水洗等；中性纤维素酶主要用于纺织水洗エ业；碱性纤维素酶则可用于洗涤剂中。エ业生产上常用的产纤维素酶微生物是常温、中温丝状真菌，它们能够产生完整的纤维素酶系，可以将结晶纤维素完全降解为葡萄糖，如木霉(Trichoderma sp.)、青霉(Penicillium sp.)、腐质霉(Humicola sp.)等等。上述菌株产生的纤维素酶大多需要在较高的温度条件下才能发挥较好的效能，在室温甚至较低的温度下，它们的酶活力都非常低。冷水纤维素酶(或低温纤维素酶)则在室温或低温下具有较高的酶活，在实际应用上，较低的温度意味着较低的能耗；特别是用冷水酶对牛仔布进行水洗处理，会产生较常温酶处理更好的质感与弾性；同时，低温酶的失活处理也较容易。因此，开发研究冷水纤维素酶在エ业上具有重要的意义。低温酶往往是由低温菌产生的。根据Moyer与Morita的定义将适冷菌分为耐冷菌(Psychrotrophs)与嗜冷菌(Psychrophiles) (Moyer&Morita, Psychrophiles andPsycherotrophs, Encyclopedia of Life Sciences, John Wiley & Sons, p 1-6，2007),以最适生长温度与耐温上限区分耐冷菌在0-5°C可以生长，最适生长温度>15°C，耐温上限在20-25°C之间；嗜冷菌在0-20°C可以生长，最适生长温度<15°C，耐温上限<20°C。目前发表过的低温纤维素酶产酶菌株有十几株，大多来自极地、海洋或高山等自然低温生境中的微生物，产酶菌种有交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)、青霉(Penicillium sp.)、木霉(Trichoderma sp.)、链霉菌(Streptomyces sp.)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonassp.)、地丝霉(Geomyces sp.)等(中国专利 CN200710190406. 0，CN200610002014. 2，CN201010174183. O)。
发明内容
本发明的ー个目的是提供一株玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus)HD1031。本发明提供的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus) HD1031,其保藏号为CGMCC No. 6148。上述的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascusroseus)HD1031 CGMCC No. 6148在制备纤维素酶中的应用也是本发明保护的范围。上述应用为发酵上述的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus)HD1031 CGMCC No. 6148，收集发酵产物，即得到纤维素酶。上述纤维素酶为冷水纤维素酶(或者低温纤维素酶),上述冷水纤维素酶具体为在4°C -50°C具有较高酶活力，优选20-30°C，其最高表观酶活力在50°C。上述纤维素酶在PH3. 0-8. 0具有较高酶活力，优选pH4. 0-6. 0，其最高表观酶活力在pH6. O。上述应用中，所述发酵的条件如下10-25°C、100-300r/min震荡培养3-15天；所述发酵采用的培养基为以纤维素为唯一或主要碳源的培养基；所述以纤维素为唯一或主要碳源的培养基具体按照如下方法制备将微晶纤维素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸ニ氢钾、氯化钙、硫酸镁和水混合，得到培养基；所述微晶纤维素在所述培养基中的浓度为10-40g/L ;所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为l-10g/L ;所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为l_20g/L ;所述磷酸ニ氢钾在所述培养基中的浓度为0. 5-10g/L ;所述氯化钙在所述培养基中的浓度为0. 1-lg/L ;所述硫酸镁在所述培养基中的浓度为0. l_2g/L。上述应用中，所述发酵的条件如下16-17°C、160r/min震荡培养10-12天；所述微晶纤维素在所述培养基中的浓度为20g/L ;所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为5g/L ;所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为10g/L ;所述磷酸ニ氢钾在所述培养基中的浓度为I. 5g/L ;所述氯化钙在所述培养基中的浓度为0. 3g/L ;所述硫酸镁在所述培养基中的浓度为0. 3g/L。本发明的另ー个目的是提供ー种制备纤维素酶的方法。本发明提供的方法,包括如下步骤发酵上述的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascusroseus) HD1031 CGMCC No. 6148，收集发酵产物，即得到纤维素酶。上述方法中，所述发酵的条件如下10-25°C、100-300r/min震荡培养3_15天；所述发酵的条件具体如下16-17°C、160r/min震荡培养10-12天；所述发酵采用的培养基为以纤维素为唯一或主要碳源的培养基；所述以纤维素为唯一或主要碳源的培养基具体按照如下方法制备将微晶纤维素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸ニ氢钾、氯化钙、硫酸镁和水混合，得到培养基；所述微晶纤维素在所述培养基中的浓度为10-40g/L，具体为20g/L ;所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为l-10g/L，具体为5g/L ;所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为l_20g/L，具体为10g/L ;所述磷酸ニ氢钾在所述培养基中的浓度为0. 5-10g/L，具体为I. 5g/L ;所述氯化钙在所述培养基中的浓度为0. 1-lg/L，具体为0. 3g/L ;所述硫酸镁在所述培养基中的浓度为0. l-2g/L，具体为0. 3g/L。上述方法中，在所述收集发酵产物后还包括如下步骤离心所述发酵产物，收集上清液得到所述纤维素酶。由上述方法制备的纤维素酶也是本发明保护的范围。本发明的第三个目的是提供ー种发酵培养基。本发明提供的发酵培养基，按照如下方法制备将微晶纤维素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸ニ氢钾、氯化钙、硫酸镁和水混合，得到培养基；所述微晶纤维素在所述培养基中的浓度为10-40g/L，具体为20g/L ;所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为l-10g/L，具体为5g/L ；所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为l_20g/L，具体为10g/L ;所述磷酸ニ氢钾在所述培养基中的浓度为0. 5-10g/L，具体为I. 5g/L ;所述氯化钙在所述培养基中的浓度为0. 1-lg/L,具体为0. 3g/L ;所述硫酸镁在所述培养基中的浓度为0. l-2g/L，具体为0. 3g/L。本发明的菌株HD1031已于2012年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生·物研究所，邮编100101),保藏号为CGMCC No. 6148,分类命名为Pseudogymnoascus roseus,为玫红假裸囊菌。本发明的实验证明，本发明通过对高山低温环境中采集的土样进行有目的的筛选研究，以开发极端环境中的微生物；本发明以纤维素粉为唯一碳源，对采自中国四川黄龙高山腐殖土土样进行富集培养，发现了一株可以产生降解纤维素粉的耐冷菌，菌株编号为HD1031,经形态学与ITS分子鉴定其为玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus)。该菌株在以纤维素为唯一或主要碳源的培养基中可诱导产生纤维素酶，最高产酶活力366U/mL。该酶最适PH6. 0，在pH3-8有活力；最适温度50°C，在4°C仍有20%酶活，在室温下具有较高的酶活，具有冷水酶的特点。
图I为HD1031降解纤维素后产生的透明圈图2为HD1031的扫描电镜照片图3为HD1031菌株的系统进化树图4为HD1031所产纤维素酶的温度-酶活5为HD1031所产纤维素酶的pH-酶活6为三种纤维素酶在不同温度下酶活力变化图7为三种纤维素酶降解滤纸实验
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus) HD1031的筛选、鉴定I、HDlO3I 的筛选土样采自中国四川黄龙高山腐殖土。平皿筛选培养基纤维素粉15g/L、(NH4) 2S045g/L、NaH2PO4L 5g/L、去氧胆酸lg/L、琼脂15g/L，pH6. 0，121°C灭菌20分钟。倒皿前加入适量青霉素，在直径9cm的平皿中加入该培养基15ml。
将土样配制成10_2_10_6浓度的悬液，取0. 5ml涂皿。室温(20_25°C )培养3周后得到一株有明显透明水解圈的菌株(见图I)，命名为HD1031。2、HD1031 的鉴定I)形态特征鉴定该菌株具有如下形态特征在PDA平板上20°C培养11天后，菌落直径11. 5mm ;分别在20°C和4°C避光培养50d后菌落分别呈现粉红色和白色，菌落直径58mm。菌丝体不透明、绒毛状，菌落呈年轮状辐射生长，边缘整齐，初期白色，老熟后灰白色，背面棕褐色；菌落中心部分凸起，顔色深，向外渐浅，中心附近有琥珀色分泌液滴，经长期多种方法培养，均未见子囊果。经插片培养，在光学显微镜下观察菌丝体细长，多分枝，有横隔；分生孢子顶生或 间生，顶生可见分生孢子梗，分生孢子呈三角状、倒卵状，节孢子多成簇、成串。经扫描电子显微镜观察，新萌发的菌丝表面较光滑，成熟菌丝表面粗糙、有突起，有纵向条纹；分生孢子、节孢子成熟后表面粗糙、有突起；节孢子脱落疤痕明显、呈同心圆状，孢子大小(3. 0±0. 2) umX (2. 0±0. 2) Um (见图 2)。该菌株在4_25°C均可生长，最适生长温度为16_18°C，超过28°C不生长，但重置于低温下部分可恢复生长。2)菌株的分子鉴定利用天根植物基因组试剂盒提取HD1031菌株基因组DNA作为PCR扩增模板，采用引物 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5’ -TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3')进行菌株 ITS 序列的扩增。按反应条件(94°C 2min，94°C 30s, 59°C 30s, 72°C 90s, 72°C 7min)扩增ITS序列，得到627bp的扩增产物，将其测序，该菌株ITS序列为序列表中的序列I。对测定的序列进行BLAST软件比较分析，并用MEGA 3. I软件进行同源性分析，建立系统发育树(图
3), HD1031与图3中的假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)的玫红假裸囊菌相似性达99%,结合该菌的形态特征确定该菌为玫红假裸囊菌Pseudogymnoascus roseus HD1031。该菌株HD1031已于2012年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101),保藏号为CGMCC No. 6148,分类命名为Pseudogymnoascus roseus,为玫红假裸囊菌。实施例2、玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus) HD1031 CGMCC No. 6148 在生产冷水纤维素酶中的应用I、种子培养将由实施例I得到的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus) HD1031 CGMCCNo. 6148接种到种子培养基PDA斜面上，在17°C培养12d。2、发酵发酵培养基(g/L):微晶纤维素PH101 (Fluka)20，硫酸铵5，蛋白胨(北京双旋)10，磷酸ニ氢钾I. 5，氯化钙0. 3，硫酸镁0. 3，pH自然。将种子斜面挖块接入发酵培养基中，在17°C、160r/min旋转摇床培养10天，收集发酵液，离心(5000g，20min),上清液即为粗酶液。3、酶活力的测定
酶活力的測定以2%羧甲基纤维素钠(Fluka)为底物，在50°C和pH6. 0条件下反应30min，按DNS法测定还原糖的量，计算上清液的酶活力。酶活力単位的定义在上述条件下，每分钟水解底物产生I U g还原糖的酶量为一个酶活力単位(U/mL)。在上述条件下，发酵上清液(粗酶液)的纤维素酶CMC酶活カ为366U/mL。实施例3、酶的性质I、最适反应温度将上述由实施例2得到的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus) HD1031CGMCC No. 6148产生的纤维素酶按照上述实施例2中3的酶活性測定方法检测，不同的是反应温度分别为 40C、12°C、20°C、30°C、40°C、50°C、60°C和 70°C。
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结果如图4所示，可以看出，由HD1031产生的纤维素酶在50°C时具有最高酶活。2、最适反应pH将上述由实施例2得到的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus) HD1031CGMCC No. 6148产生的纤维素酶按照上述实施例2中3的酶活性测定方法检测，不同的是反应 PH 分别为 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,6. 6,7. 2 和 8. 0 (其中 pH3. 0-5. 0 为 0. IM 醋酸-缓冲液，pH6. 0-8. 0为0. IM磷酸盐缓冲液)。结果如图5所示，可以看出，由HD1031产生的纤维素酶在最适pH为6. 0，在此pH
值下具有最高酶活。实施例4、玫红假裸囊菌HD1031生产的纤维素酶与其它纤维素酶的活性比较I、低温条件下酶活特性将由实施例2得到的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus) HD1031 CGMCCNo. 6148产生的纤维素酶、由特异腐质霉(CGMCC3. 4393)所产的中性纤维素酶和由康宁木霉(CGMCC3.4001)所产的酸性纤维素酶(制备方法均记载在崔福绵真菌学报3 (I)59-64，1984 ；)按照前述的酶活性測定方法检测，不同的是反应温度分别为4°C、10°C、20°C、30°C和 50。。。结果如图6，可以看出，中性纤维素酶和酸性纤维素酶在低温条件下酶活下降明显，其中酸性纤维素酶在10°c时基本无酶活性，而HD1031所产的纤维素酶在4°C时相比其最适温度下酶活仍有24%的酶活。以上说明该HD1031所产纤维素酶在低温条件下酶活性较好。2、滤纸崩解实验将由实施例2得到的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus) HD1031 CGMCCNo. 6148产生的纤维素酶、由特异腐质霉(CGMCC3. 4393)所产的中性纤维素酶和由康宁木霉(CGMCC3. 4001)所产的酸性纤维素酶调节至相同酶活(300U/mL)，取以上调节后的三种酶液Iml与含50 ± Img的新华I号滤纸条在5ml缓冲液(酸性酶为0. lM、pH4. 8醋酸盐缓冲液，HD1031与中性纤维素酶在0. 1M、pH6. 0磷酸盐缓冲液中)中相混合，在23°C，100r/min旋转摇床中震荡反应，測定滤纸崩解时间。约3小时HD1031所产的纤维素酶可将滤纸完全崩解，中性酶滤纸条较完整，酸性酶基本无降解(图7，F为腐质霉所产中性纤维素酶，木为木霉所产酸性纤维素酶，中间位HD1031所产纤维素酶)。这说明HD1031所产的纤维素酶在室温下较腐质霉与木霉所产的纤维素酶在室温下具有更好的水解纤维素的能力，具有重要的エ业应用价值。·
权利要求
1.玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascusroseus) HD1031,其保藏号为 CGMCC No. 6148。
2.权利要求I所述的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascusroseus) HD1031 CGMCCNo. 6148在制备纤维素酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于 所述应用为发酵所述权利要求I所述的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus)HD1031 CGMCC No. 6148，收集发酵产物，即得到纤维素酶。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于 所述发酵的条件如下10-25°C、100-300r/min震荡培养3_15天； 所述发酵采用的培养基为以纤维素为唯一或主要碳源的培养基；所述以纤维素为唯一或主要碳源的培养基具体按照如下方法制备将微晶纤维素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁和水混合，得到培养基；所述微晶纤维素在所述培养基中的浓度为10-40g/L ;所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为l-10g/L ;所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为l-20g/L ;所述磷酸二氢钾在所述培养基中的浓度为0. 5-10g/L ;所述氯化钙在所述培养基中的浓度为0. 1-lg/L ;所述硫酸镁在所述培养基中的浓度为0. l_2g/L。
5.根据权利要求2-4中任一所述的应用，其特征在于 所述发酵的条件如下16-17°C、160r/min震荡培养10-12天； 所述以纤维素为唯一或主要碳源的培养基中，所述微晶纤维素在所述培养基中的浓度为20g/L ;所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为5g/L ;所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为10g/L ;所述磷酸二氢钾在所述培养基中的浓度为I. 5g/L ;所述氯化钙在所述培养基中的浓度为0. 3g/L ;所述硫酸镁在所述培养基中的浓度为0. 3g/L。
6.一种制备纤维素酶的方法，包括如下步骤发酵所述权利要求I所述的玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus) HD1031 CGMCC No. 6148,收集发酵产物，即得到纤维素酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于 所述发酵的条件如下10-25°C、100-300r/min震荡培养3_15天； 所述发酵的条件具体如下16-17°C、160r/min震荡培养10-12天； 所述发酵采用的培养基为以纤维素为唯一或主要碳源的培养基；所述以纤维素为唯一或主要碳源的培养基具体按照如下方法制备将微晶纤维素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁和水混合，得到培养基；所述微晶纤维素在所述培养基中的浓度为10-40g/L，具体为20g/L ;所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为l-10g/L，具体为5g/L ;所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为l_20g/L，具体为10g/L;所述磷酸二氢钾在所述培养基中的浓度为0. 5-10g/L，具体为I. 5g/L ;所述氯化钙在所述培养基中的浓度为0. 1-lg/L，具体为0.3g/L ;所述硫酸镁在所述培养基中的浓度为0. l-2g/L，具体为0. 3g/L。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于 在所述收集发酵产物后还包括如下步骤离心所述发酵产物，收集上清液得到所述纤维素酶。
9.由权利要求6-8任一所述方法制备的纤维素酶。
10.一种发酵培养基，按照如下方法制备将微晶纤维素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁和水混合，得到培养基；所述微晶纤维素在所述培养基中的浓度为10-40g/L，具体为20g/L ;所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为l-10g/L，具体为5g/L ;所述蛋白胨在所述培养基中的浓度为l_20g/L，具体为10g/L ;所述磷酸二氢钾在所述培养基中的浓度为0. 5-10g/ L，具体为I. 5g/L ;所述氯化钙在所述培养基中的浓度为0. 1-lg/L，具体为0. 3g/L ;所述硫酸镁在所述培养基中的浓度为0. l-2g/L，具体为0. 3g/L。
全文摘要
本发明公开了一株耐冷菌玫红假裸囊菌及其在制备冷水纤维素酶中的应用。本发明提供了一株玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus)HD1031，其保藏号为CGMCC No.6148。本发明还提供了玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus)HD1031 CGMCC No.6148在制备纤维素酶中的应用。本发明从中国四川黄龙高山腐殖土筛选出玫红假裸囊菌HD1031，将该菌株进行发酵培养，发酵产物即为纤维素酶，且为冷水纤维素酶，在室温下有较高酶活。
文档编号C12N1/14GK102787076SQ20121020658
公开日2012年11月21日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者张国青, 杨敬, 石家骥, 钞亚鹏, 钱世钧, 韩龙 申请人:中国科学院微生物研究所