专利名称：用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用。
背景技术：
野生稻在植物分类学上隶属于单子叶植物纲、禾本目、禾本科，野生稻为禾本科稻属野生种的泛称，1973年，被誉为“杂交稻之父”的中国著名水稻专家袁隆平利用在海南发现的一株野生稻，成功培育出杂交水稻，掀起了水稻生产的“第二次緑色革命”。中国野生稻资源是中国稻种资源的重要组成部分，作为栽培稻的野生亲缘种，具有栽培稻中缺少或已消失的优异基因，如抗寒性、抗病虫性、抗逆、雄性不育种质、恢复种质等构成了水稻遗传改良的重要基因源。然而近年来，随着经济的发展，人类活动严重干扰和破坏了野生稻、的生存环境，加上物种流失的加剧，使野生稻处于严重的濒危状态和灭绝的边缘，所以保护和鉴定野生稻尤为重要。在20多个野生稻种中，我国只分布有三种野生稻即普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.),药用野生稻(Oryza officinalis Wall, ex Watt.)和抚粒野生稻(Oryza granulata Nees et Am. ex Watt.)。其中抚粒野生稻被定为国家ニ级保护植物，列入中国植物红皮书。鉴于目前还没有关于疣粒野生稻鉴定技术方面的报道，因此建立疣粒野生稻的查验技术方法以便于ロ岸查验应用，以及对于防止我国重要物种资源流失等方面具有十分重要的意义。近年来，以DNA为基础的分子标记技术如RFLP、RAPD, SSR、AFLP等在稻属植物的系统关系研究中被广泛应用，但是对于确立稻属植物种间系统关系，DNA标记所提供的信息位点有限。植物细胞中存在3套基因组核基因组(nDNA)、叶绿体基因组(cpDNA)和线粒体基因组(mtDNA)，因其结构和功能上的差异，进化速率也有所不同，在植物系统发育重建中，来自叶绿体基因组的DNA片段和来自核基因编码核糖体的DNA片段是两个最主要的分子证据来源，线粒体基因组的进化速率慢且在植物不同种间的基因组结构和基因排序变异非常大，在系统发育研究中应用有限。单拷贝核基因(single-copy nuclear gene)是指基因组中拷贝数目少，只有I个或几个拷贝的核基因，多数是生物体内组成型表达的持家基因，具有中等程度的进化速率和适合系统发育分析的基因结构，在许多植物类群的研究中，单拷贝核基因相比含有更多的信息位点，具有更大的潜力来重建系统发育。磷酸丙糖异构酶(Triose phosphateisomerase, TPI)是糖酵解过程中催化ニ羟丙酮磷酸与3_磷酸甘油醛之间可逆反应的ー种异构酶，其催化功能高度保守，其基因分子结构在生物的长期进化中未发生大的改变，可作为生物遗传分化和分子进化研究中的重要指标。近年来，有研究发现水稻胞质TPI是单拷贝基因，且为直系同源基因(orthologs,也称直向同源和垂直同源),该基因的进化史可以反映物种的进化
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用。本发明通过对稻属(Oryza L.)及其近缘属等18个禾本科植物单拷贝核基因TPI序列进行扩增和测序， 分析其系统进化关系及序列差异，得到用于鉴定疣粒野生稻(O. granulata)的特异性分子标记。序列分析表明，栽培稻间TPI基因序列碱基变异少,野生稻相对变异丰富，其中疣粒野生稻变异尤为明显，根据疣粒野生稻的TPI基因序列特异位点设计引物，利用该特异性分子标记可实现对疣粒野生稻的准确鉴定。为了实现本发明目的，本发明的一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记，其位于禾本科植物单拷贝核基因TPI序列上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本发明还提供用于鉴定疣粒野生稻的特异性PCR引物，包括正向引物F5' -CAGTGGTGGAGCCAGAAATT-3，和反向引物 R5’ -GCTTAATCAGGGGCAGAGGC-3’。本发明还提供所述特异性分子标记在鉴定疣粒野生稻中的应用，其包括步骤1)提取待测植株的基因组DNA ;2)以待测植株的基因组DNA为模版，利用权利要求2所述引物F和R，进行PCR扩增反应；3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出如SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的产物，则待测植株为疣粒野生稻。其中，PCR反应体系以25 μ I计为30ng/μ I模板DNA I μ 1，IOpmol/μ I引物F和R 各 I μ 1,2. 5mmol/L dNTP mix2. O μ l,5U/y L Taq DNA 聚合酶 O. 3 μ I，10XPCR 反应缓冲液 2. 5 μ l,25mmol/L MgCl22 μ I，余量为水。PCR 反应条件为94°C 5 分钟；94°C 30 秒，60°C 30 秒，72°C 30 秒，24 个循环；72 °C 10 分钟。本发明还提供含有引物F和R的用于检测疣粒野生稻的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的ー种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明进一歩提供用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记在植物分子标记辅助育种中的应用。本发明通过对稻属(Oryza L.)及其近缘属等18个禾本科植物单拷贝核基因TPI序列的比较分析，根据不同属间具有较丰富的碱基差异，并基于序列差异位点的分析，开发出物种特异的分子标记进行物种鉴定，为ロ岸快速鉴定珍稀物种提供了可靠的检测方法。利用本发明提供的特异性分子标记可实现对疣粒野生稻的快速、准确检測。
图I为水稻材料TPI基因扩增结果；其中，M DNA marker DL500 ；1 :宽叶野生稻；
2:高杆野生稻；3 :斑点野生稻；4 :紧穗野生稻；5 :药用野生稻；6 :疣粒野生稻；7 :根茎野生稻；8 :普通野生稻；9 :桂林野生稻；10 :东乡野生稻；11 :普野临高；12 :普野东方；13 :普野乐东；14 :普野琼海；15 :日本睛；16 :湘矮早7 ；17 :新香优80 ；18 :水对照。图2为TPI基因系统发生树；其中，缩写字母代表的水稻材料名称见表I。图3为稻属及其近缘属植物TPI基因序列比对结果；其中，縮写字母代表的水稻材料名称见表I 表示缺失碱基；“ · ”表示相同碱基；方框部分为疣粒野生稻特异碱基位点。图4为ptYL211片段PCR扩增结果；其中，M DNA marker DL500 ；1 :宽叶野生稻；2 :高杆野生稻；3 :斑点野生稻；4 :紧穗野生稻；5 :药用野生稻；6 :疣粒野生稻；7 :根茎野生稻；8 :普通野生稻；9 :桂林野生稻；10 :东乡野生稻；11 :普野临高；12 :普野东方；13 :普野乐东；14 :普野琼海；15 :日本睛；16 :湘矮早7 ；17 :新香优80 ；18 :水对照。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如SambiOOk等分子克隆实验手册'(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。实施例I用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记的获得
I材料与方法 I. I 材料I. I. I植物材料本实施例中所选材料的具体名称及材料来源见表1，用于实验的植物材料为硅胶干燥的叶片。表I实验材料及其分类
编号缩写品种麵来源
1BL宽叶野生稻Broad leaf wild riceO-Iafifolia云南
2TC'高ft 野啐柄Tall culm wiki riceOalta-天南
3Sp斑点野生稻Spot wild riceO-punctata云南
4CS%德野生,1 Contracted spike wild r Cl O-eichingeri云 南
5Me药用野生稻Medicinal wild riceO officinalis^ 云南
6Gr疵粒野生福Granulate wild riceO. granulate厂云南
7Rh根: .野生柄Rhizorne wild liceO.rhizomatis^ 云雨
8WR普通野生稻Wild riceO rufipogon.云南
9GL桂林野生稻Guilin wild rice^广西
10DX东乡野生稻Dongxiang wild rice广西
11LG普野临高Lingao wild rice海南
12DF普野东方Dongfang wild rice海南
13LD普野乐东Ledong wild rice海南
14QH普野琼海Qionghai wild rice海南
15Nip 日本晴 Nipponbare奪歷湖南
16XAZ7 湘矮早 7 Xiang，aizao 7湖南
17XXY80 新香侁 80 Xinxiangyou 80P個湖南
18Le 假稻Leersia tisseranttiLeersia(並み I ム最罵)I. I. 2 试剂
PCR扩增所用试剂均购自大连宝生物有限公司，引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，测序由上海生物工程技术服务有限公司完成。I. 2 方法1.2.1 DNA 提取硅胶干燥的水稻叶片IOOmg置于事先加入4mm钢珠的2mlEP管中，迅速放入液氮中冷冻30min,将EP管置于Geno/Grinder 2000 (SPEX SamplePrep)高通量研磨机上，研磨3min, 1000rpm/min。按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒提取叶片总DNA。I. 2. 2TPI基因扩增及测序根据ZouXH 等文献中引物 TPI-F:5' -TCAGCCCACCTTATGTGTTC-3' ；TPI-R:5/ -TGTGCAGCAACAACATCCAT-3'，以所提取的叶片总DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系以25 μ I 计为30ng/y I 模板 DNA I μ I, lOpmol/μ I 引物 TPI-F 和 TPI-R 各 I μ 1,2. 5mmol/L dNTP mix2. Ομ I, 5U/μ LTaq DNA 聚合酶 O. 3 μ 1，IOXPCR 反应缓冲液 2· 5 μ 1，25mmol/LMgCl22y 1，余量为水。PCR扩增程序为94°C预变性5分钟；94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；72°C终延伸10min，4°C保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，由上海生物工程技术服务有限公司测序，扩增引物同时作为测序引物进行双向测序。I. 2. 3序列分析及系统树构建序列编辑和拼接应用Lasergenev7. I软件中的SeqMan完成，用ClustalX进行序列比对，序列比对后，以假稻(Leersia tisserantti)为外类群(Genbank登录号为EF577628)，使用MEGA5. I软件进行系统发育分析。空位(Gap)被处理为缺失(Missing)，主要以邻接法构建系统分支树。NJ树序列间分化程度使用Kimura的ニ參数距离度量，每一分 支的bootstrap支持率的计算设定为1000次重复取样的计算结果。I. 2. 5PCR扩增特异片段设计上游引物F (5 ' -CAGTGGTGGAGCCAGAAATT-3 ')和下游引物R(5 ' -GCTTAATCAGGGGCAGAGGC-3 ')，将I. 2. 2中TPI基因扩增产物稀释30倍后作为模板，扩增体系以25 μ I计为模板I μ 1，I Opmo I/ μ I引物F和R各I μ 1，2. 5mmol/LdNTP mix2. 0μ l，5U/y L Taq DNA 聚合酶 O. 3 μ 1，10XPCR 反应缓冲液 2· 5 μ 1，25mmol/LMgCl22y 1，余量为水。PCR扩增程序为94°C预变性5分钟；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，24个循环；72°C终延伸lOmin。2%琼脂糖凝胶电泳检查結果。2 结果 2. I植物材料DNA提取及TPI基因扩增本实施例中，将多个水稻叶片同时在Geno/Grinder 2000高通量组织研磨仪内进行研磨，可以一次获得大規模的DNA样本，大大提高了实验效率。研磨后样品直接用TIANGEN试剂盒提取DNA效果较好，样品浓度均在50-100 μ g/ μ L,可用于后续试验。TPI基因的扩增产物为一条930bp的条带(图I )，该PCR产物纯化后送上海生エ测序。2. 2TPI基因序列分析和特异引物设计用Lasergenev7. I软件进行序列的剪切、拼接和统计等分析,确保序列的准确性，保存成FASTA或纯文本格式。用ClustalX软件进行排序，个别位点手工校对，使用MEGA5. I软件进行系统发育分析。根据序列相似度绘制的系统发生树(图2)，由NJ树可以看出，禾本科材料中的稻属和其近缘属假稻属植物(Leersia tisserantti)呈明显的并系关系。对18个禾本科植物TPI基因序列的差异碱基进行了比较，近缘属假稻属与稻属序列差异位点明显，栽培稻间碱基变异少，野生稻相对变异丰富，其中疣粒稻变异尤为明显，根据抚粒野生稻特异片段(图3方框部分)，通过Primer premier 5软件设计特异引物F、R，将扩增的目的片段命名为ptYL211。2. 3ptYL211特异性的检测用ptYL211特异引物F、R，在60°C退火温度下多个材料PCR扩增试验，由图4可以看出，只有疣粒野生稻有163bp条带，其他的材料几乎无扩增，可以达到鉴定疣粒野生稻的目的。切胶纯化上述条带，测序得到扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作ー些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记，其特征在于，其位于禾本科植物单拷贝核基因TPI序列上,它的核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.用于鉴定疣粒野生稻的特异性PCR引物，其特征在于，包括正向引物F5' -CAGTGGTGGAGCCAGAAATT-3’ 和反向引物 R5’ -GCTTAATCAGGGGCAGAGGC-3’。
3.权利要求I所述的特异性分子标记在鉴定疣粒野生稻中的应用，其包括步骤 1)提取待测植株的基因组DNA； 2)以待测植株的基因组DNA为模版，利用权利要求2所述引物F和R，进行PCR扩增反应； 3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出如SEQID NO. I所示核苷酸序列的产物，则待测植株为疣粒野生稻。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在干，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以 25 ii I 计为30ng/ii I 模板 DNA I U 1，IOpmol/U I 弓I 物 F 和 R 各 I y 1，2. 5mmol/LdNTP mix2. Ou l,5U/u L Taq DNA 聚合酶 0. 3 y 1，IOXPCR 反应缓冲液 2. 5 y 1，25mmol/LMgCl22iil，余量为水。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的条件为94°C5 分钟；94°C 30 秒，60°C 30 秒，72°C 30 秒，24 个循环；72°C 10 分钟。
6.含有权利要求2所述引物的用于检测疣粒野生稻的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的ー种或多种。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
9.权利要求I所述用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记在植物分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用，该分子标记位于禾本科植物单拷贝核基因TPI序列上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明提供的特异性分子标记可实现对疣粒野生稻的快速、准确检测，为口岸快速鉴定珍稀物种提供了可靠的检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102732628SQ20121021373
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月25日 优先权日2012年6月25日
发明者宋云, 徐晗, 李明福, 陈岩 申请人:中国检验检疫科学研究院