一种心脏疾病药物筛选模型的建立方法
【专利摘要】本发明提供了一种心脏疾病药物筛选模型的建立方法，包括以下步骤：A）构建包含四种转录因子的病毒载体，所述转录因子为Oct3/4、Sox2、c-Myc和klf4；B）将步骤A）中病毒载体转染病毒包装细胞，获得病毒液；C）将步骤B）中病毒液感染beta肾上腺能受体野生型基因敲除鼠的成纤维细胞；D）筛选类似于鼠胚胎干细胞的克隆进行传代培养，获得beta肾上腺能受体野生型基因缺陷的诱导多能干细胞；E）构建包含beta肾上腺能受体突变型基因的病毒载体；F）将步骤E）中病毒载体转染病毒包装细胞，获得病毒液；G）将步骤F）中病毒液感染步骤D）中beta肾上腺能受体野生型基因缺陷的诱导多能干细胞；H）挑选阳性克隆，诱导分化成心肌细胞。
【专利说明】一种心脏疾病药物筛选模型的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，具体地说，是一种心脏疾病药物筛选模型的建立方法。【背景技术】
[0002]心脏是人体内不可再生器官，心脏的病变是无法自我修复的，并且会对病人产生致命的影响，因此心脏疾病的治疗与诊断成为一个医学难题。干细胞(Stem Cells)是一类具有自我更新及多能分化潜力的特殊细胞，它能够分化成人体内各种类型的细胞。1981年，Martin John Evans和Matthew Kaufman实验室成功培养出小鼠胚胎干细胞(ES细胞)。多项研究表明，体外培养的胚胎干细胞可以诱导成为心肌细胞，因此利用干细胞定向分化成心肌细胞能够为心脏疾病的治疗、诊断及药物评估提供新的思路。2006年，Yamanaka实验室将0ct3/4、Sox2、c-Myc和klf4四种转录因子转染到小鼠的成纤维细胞中，成功地诱导出了类似于胚胎干细胞的诱导多能干细胞(IPS细胞)，该细胞与鼠胚胎干细胞一样具有全能型，这为建立取得病人特异性的类似胚胎干细胞的诱导的多能干细胞的模型提供可能性。
[0003]心脏疾病的发病原因较多，其中一些发病的机制与beta肾上腺能受体(betaadrenergic receptor)多态性密切相关。最近研究发现,beta肾上腺能受体的某些SNP如betalAR R389G和beta2AR G16R与心脏疾病的发生存在很大的相关性，其中betalAR R389G的心脏病发病率是野生型病人的1.51倍，beta2AR G16R能够引起肥胖，其心脏病发病率是野生型的10倍。目前临床上针 对于beta肾上腺能受体的药物种类较多，但大多副作用较大，作用效果因人而异，且没有针对于betalAR R389G和beta2AR G16R的单一药物。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种心脏疾病药物筛选模型的建立方法。
[0005]本发明的另一目的在于提供一种上述方法建立的心脏疾病药物筛选模型。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种上述药物筛选模型在beta肾上腺能受体多态性相关的心脏疾病药物筛选中的应用。
[0007]本发明的心脏疾病药物筛选模型的建立方法，所述药物筛选模型用于筛选beta肾上腺能受体多态性相关的心脏疾病药物，包括以下步骤:
[0008]A)、构建包含四种转录因子的病毒载体，所述转录因子为0ct3/4、Sox2、c_Myc和klf4 ；
[0009]B)、将步骤A)中病毒载体转染病毒包装细胞，获得病毒液；
[0010]C)、将步骤B)中病毒液感染beta肾上腺能受体野生型基因敲除鼠的成纤维细胞；
[0011]D)、筛选类似于鼠胚胎干细胞的克隆进行传代培养，获得beta肾上腺能受体野生型基因缺陷的诱导多能干细胞；
[0012]E)、构建包含beta肾上腺能受体突变型基因的病毒载体；
[0013]F)、将步骤E)中病毒载体转染病毒包装细胞，获得病毒液；
[0014]G)、将步骤F)中病毒液感染步骤D)中beta肾上腺能受体野生型基因缺陷的诱导多能干细胞；
[0015]H)、挑选阳性克隆，诱导分化成心肌细胞。
[0016]根据本发明，所述病毒载体为慢病毒。
[0017]根据本发明，所述病毒包装细胞为293T细胞。
[0018]根据本发明的优选实施例，所述beta肾上腺能受体野生型基因为betalAR或beta2AR。
[0019]根据本发明的优选实施例，所述beta肾上腺能受体突变型基因为betalARR389G或 beta2AR G16R。
[0020]本发明具有如下有益效果:
[0021]1、心脏疾病的发病原因复杂，目前临床上用于治疗心脏病的药物较多，且副作用较大，无法实现个性化疗法。本发明针对已有的病人群体中重要的肾上腺素受体多态性，建立的betalAR R389G和beta2AR G16R心脏药物筛选模型为最终实现病人个性化疗法提供重要的基础。
[0022]2、本发明诱导获得的betalAR R389G和beta2AR G16R心肌细胞可直接用于心脏药物筛选模型，快速，简单。
[0023]本发明基于病人致病基因多态性并应用干细胞技术建立了新型的心脏药物的筛选模型，在心脏疾病的治疗与诊断方面具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
`染色鉴定结果图。
[0025]图2为心脏细胞特异性Marker染色鉴定结果图。
[0026]图3a为野生型betalAR及突变型betalAR R389G蛋白表达水平检测结果图；图3b为野生型beta2AR及突变型beta2AR G16R蛋白表达水平检测结果图。
[0027]图4a为野生型betalAR及突变型betalAR R389G cAMP响应检测结果图；图4b为野生型beta2AR及突变型beta2AR G16R cAMP响应检测结果图。
【具体实施方式】
[0028]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
[0029]实施例1、IPS细胞的制备
[0030]1.1、慢病毒包被0ct3/4、Sox2、c_Myc和klf4四种转录因子
[0031]利用PCR技术从小鼠总cDNA中扩增出0ct3/4、Sox2、c_Myc和klf4四个转录因子。PCR扩增使用引物序列如下:
[0032]0ct3/4:5’ 引物:5，-ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGAC-3，
[0033]3，引物:5，-GTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG-3’
[0034]Sox2:5，引物:5，-ATGTATAACATGATGGAGACGGAG-3’
[0035]3，引物:5，-CATGTGCGACAGGGGCAGTG-3’
[0036]c-Myc:5，引物:5，-ATGCCCCTCAACGTGAACTTCAC-3，
[0037]3，引物:5，-TGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTC-3，[0038]klf4:5’ 引物:5’ -ATGAGGCAGCCACCTGGCG-3’
[0039]3，引物:5，-AAAGTGCCTCTTCATGTGTAAGG-3，。
[0040]将四种转录因子的PCR扩增产物分别接入到慢病毒载体lent1-ef Ia-EGFP (购自Invitrogen)，共转染病毒包装细胞，即293T细胞(来自美国Duke大学)。培养48~72hrs，收集含有病毒的上清培养液。将上清液通过45 μ m过滤器，然后移入无菌储存管中，保存备用。
[0041]1.2、慢病毒感染鼠成纤维细胞
[0042]将1.1中构建的包含0ct3/4、Sox2、c-Myc和klf4四种转录因子的慢病毒分别感染betalAR和beta2AR基因敲除鼠(来源自美国JACKSON实验室)的成纤维细胞。转染24小时后，将细胞转到预铺有滋养层细胞的培养瓶中，每隔一周更换一次胚胎干细胞培养基。三周之后，筛选类似于鼠胚胎干细胞的克隆进行传代培养。
[0043]实验分为两组:
[0044]a、空白对照组:携带有绿色荧光蛋白的慢病毒；
[0045]b、实验组:包含0ct3/4、Sox2、c-Myc和klf4四种转录因子的慢病毒组
[0046]合，将含有四种转录因子的慢病毒同时转染到成纤维细胞中。
[0047]所述成纤维细胞的 分离与制备方法如下:取妊娠13.5天的基因敲除的母鼠的胚胎，将胚胎的躯干部分用PBS冲洗干净。将组织块剪碎，移入50mL离心管中，加入
0.125%胰酶于37°C消化20min，直到出现大量单细胞，加入MEF完全培养基(DMEM，10%FBS,Invitrogen)终止，吹打后制成细胞悬液。将细胞悬液转入IOOmm培养皿中，补加适量培养基。来回晃动培养皿后，置于37°C细胞培养箱培养。
[0048]所述滋养层细胞的制备方法如下:取怀孕12-13天的CF-1小鼠的胚胎，去除头和肝脏，用PBS洗三次，将组织充分剪碎，加入0.25%胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。用同样体积的MEF完全培养基(DMEM，10%FBS，Invitrogen)中和胰酶。将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5% CO2培养箱中培养。传代三次后使用gama射线辐照仪，以50-80戈雷辐照，然后1000rpm离心5分钟，保存备用。
[0049]所述胚胎干细胞培养基组成如下:knockout DMEM 425ml,FBS (干细胞)75ml，NEAA5ml, L-G 5ml,0.1mM β -mercaptoethanol 3.6 μ I, LIF 1000U/ml。
[0050]实施例2、IPS细胞全能性的鉴定
[0051]为了验证实施例1中获得的IPS细胞的多能性，使之自然分化形成拟胚体(EB)Jf拟胚体进行切片处理，利用三个胚层特异性Marker抗体进行染色，观察各个胚层的表达情况。其中，内胚层特异性Marker为AFP，Soxl7 ;中胚层特异性Marker为SM，a-actin ;外胚层特异性Marker为Nestin, Tujl。结果如图1所示，可以观察到有克隆形成。
[0052]实施例3、IPS细胞定向诱导分化成心肌细胞
[0053]利用定点突变技术将野生型的betalAR和beta2AR基因突变成betalARR389G和beta2AR G16R基因，然后将野生型betalAR和beta2AR基因和突变型betalAR R389G和beta2AR G16R基因接入到慢病毒载体lent1-ef Ia-EGFP (购自Invitrogen)，共转染病毒包装细胞，即293T细胞(来自美国Duke大学)。培养48~72hrs，收集含有病毒的上清培养液。将上清液通过45 μ m过滤器，然后移入无菌储存管中，保存备用。
[0054]将上述慢病毒感染实施例1中获得的IPS细胞，实验分为3组:[0055]a、空白对照组:携带绿色荧光蛋白的慢病毒；
[0056]b、将野生型betalAR和突变型betalAR R389G转染到betalAR缺陷型
[0057]IPS 细胞中；
[0058]C、将野生型beta2AR和突变型beta2AR G16R转染到beta2AR缺陷型的IPS细胞中。
[0059]分别选择空白对照组，野生型betalAR,突变型betalAR R389G,野生型beta2AR,突变型beta2AR G16R的阳性克隆继续培养。其中，阳性克隆含有G418抗性，通过G418进行筛选。
[0060]将上述阳性克隆及对照组胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞，诱导分化步骤如下:将IPS细胞在无滋养层的基质胶上培养3代，在心肌细胞分化前，将IPS细胞用胚胎干细胞培养基传代，细胞密度达到80%以上。向胚胎干培养基中加入终浓度为50ng/ml的bFGF，和100ng/ml的Activin。培养24小时的时候加入终浓度为10ng/ml的BMP4。用上述溶液培养四天后，更换新鲜培养基，同时加入终浓度分别为10ng/ml和20ng/ml的DKKl和VEGF。培养四天后更换新鲜培养基，同时加入终浓度为10ng/ml的DKKl和50ng/ml的bFGF。一周后可见到跳动的心肌细胞，可用于后续试验。
[0061]实施例4、心肌细胞鉴定
[0062]4.1、特异性 Marker 检测
[0063]将实施例3中获得的心肌细胞使用特异性Marker (c-TNT)检测。结果如图2所示，诱导的心肌细胞用心肌细胞特异性抗体ant1-cTNT检测成阳性，证明已经诱导成了心肌细胞。`
[0064]4.2、betalAR、betalAR R389G、beta2AR、beta2AR G16R 表达情况检测
[0065]将实施例3中获得的心肌细胞使用western blot检测betalAR、betalARR389G、beta2AR、beta2AR G16R的表达情况。结果如图3所示，从图3a、3b可以看到，突变型BetalARR389G、Beta2AR G16R与野生型BetalAR、Beta2AR的蛋白表达没有差异。
[0066]4.3、第二信使 c-AMP 检测
[0067]分别用betalAR和beta2AR特异性激动剂Xamoterol和Fenoterol刺激实施例3中获得的心肌细胞，采用ELISA的方法检测第二信使c-AMP的变化。c-AMP可以激活其下游的c-AMP依赖的PKA的活性，进而导致其下游一些信号蛋白的磷酸化，引起心肌细胞正性变时，变力，变传导作用。结果如图4所示，用betalAR和beta2AR特异性激动剂Xamoterol和Fenoterol刺激心肌细胞后，突变型betalAR R389G和beta2AR G16R引起下游cAMP增加。其中，野生型 betalAR 的 cAMP 为 7.65nM,突变型 betalAR R389G 的 cAMP 为 22.65nM,是野生型的 3 倍；野生型 beta2AR 的 cAMP 为 8.12nM,突变型 beta2ARG16R 的 cAMP 为 35.26nM,是野生型的4.3倍。
[0068]betalAR R389G和beta2AR G16R基因多态性增加细胞内c_AMP浓度是导致其产生心脏病表型的原因之一。本实施例的结果证明成功获得了突变型的心肌细胞，同时，本实施例的结果证明本发明利用小鼠模型构建的突变型心肌细胞重现了人类的病理性特征，因而可用于人类beta肾上腺能受体多态性相关的心脏疾病药物的筛选，并且可通过抑制betalAR R389G和beta2AR G16R活力来治疗心脏病。
[0069]综上所述，本发明利用betalAR和beta2AR的基因敲除鼠为模型，首先诱导获得betalAR和beta2AR基因缺失的IPS细胞，然后将betalAR R389G和beta2AR G16R基因转染到上述IPS细胞中，最后将该IPS细胞诱导成心肌细胞，建立了一种基于病人致病基因
betalARR389G和beta2AR G16R的心脏药物的筛选模型。本发明的药物筛选模型可以用于筛选beta肾上腺能受体多态性相关的心脏疾病药物，这对于本领域的技术人员是显而易见的。
[0070]序列表
[0071]〈110〉上海勃德生物科技有限公司
[0072]<120> 一种心脏疾病药物筛选模型的建立方法
[0073]<130)121028
[0074]<160>8
[0075]<170>PatentIn version 3.3
[0076]<210>1
[0077]<211>24
[0078]<212>DNA
[0079]〈213〉合成
[0080]〈220〉
[0081]<221>primer
[0082]〈222〉(I)..(24)
[0083]〈400〉I
[0084]atggctggac acctggcttc agac24
[0085]<210>2
[0086]<211>24
[0087]<212>DNA
[0088]〈213〉合成
[0089]〈220〉
[0090]<221>primer
[0091]〈222〉(I)..(24)
[0092]<400>2
[0093]gtttgaatgc atgggagagc ccag24
[0094]<210>3
[0095]<211>24
[0096]<212>DNA
[0097]〈213〉合成
[0098]〈220〉
`[0099]<221>primer
[0100]〈222〉(I)..(24)
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[0102]atgtataaca tgatggagac ggag24
[0103]<210>4[0104]<211>20
[0105]<212>DNA
[0106]〈213〉合成
[0107]〈220〉
[0108]<221>primer
[0109]〈222〉(I)..(20)
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[0111]catgtgcgac aggggcagtg20
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[0114]<212>DNA
[0115]〈213〉合成
[0116]〈220〉
[0117]<221>primer`
[0118]〈222〉(I)..(23)
[0119]〈400>5
[0120]atgcccctca acgtgaactt cac23
[0121]<210>6
[0122]<211>24
[0123]<212>DNA
[0124]〈213〉合成
[0125]〈220〉
[0126]<221>primer
[0127]〈222〉(I)..(24)
[0128]〈400>6
[0129]tgcaccagag tttcgaagct gttc24
[0130]<210>7
[0131]<211>19
[0132]<212>DNA
[0133]〈213〉合成
[0134]〈220〉
`[0135]<221>primer
[0136]〈222〉(I)..(19)
[0137]<400>7
[0138]atgaggcagc cacctggcg19
[0139]<210>8
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[0142]〈213〉合成[0143]〈220〉
[0144]<221>primer
[0145]<222〉(I)..(23)
[0146]<400>8
[0147]aaagtgcctc ttcatgtgta agg23
【权利要求】
1.一种心脏疾病药物筛选模型的建立方法，所述药物筛选模型用于筛选beta肾上腺能受体多态性相关的心脏疾病药物，其特征在于，所述方法包括以下步骤: A)、构建包含四种转录因子的病毒载体，所述转录因子为0Ct3/4、SOX2、C-MyC和klf4； B)、将步骤A)中病毒载体转染病毒包装细胞，获得病毒液； C)、将步骤B)中病毒液感染beta肾上腺能受体野生型基因敲除鼠的成纤维细胞； D)、筛选类似于鼠胚胎干细胞的克隆进行传代培养，获得beta肾上腺能受体野生型基因缺陷的诱导多能干细胞； E)、构建包含beta肾上腺能受体突变型基因的病毒载体； F)、将步骤E)中病毒载体转染病毒包装细胞，获得病毒液； G)、将步骤F)中病毒液感染步骤D)中beta肾上腺能受体野生型基因缺陷的诱导多能干细胞； H)、挑选阳性克隆，诱导分化成心肌细胞，即为心脏疾病药物筛选模型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒包装细胞为293T细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述beta肾上腺能受体野生型基因为betalAR 或 beta2AR。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述beta肾上腺能受体突变型基因为betalAR R389G 或beta2AR G16R。
6.如权利要求f5中任一项所述方法建立的心脏疾病药物筛选模型。
7.如权利要求6所述的药物筛选模型在beta肾上腺能受体多态性相关的心脏疾病药物筛选中的应用。
【文档编号】C12N5/10GK103509824SQ201210215905
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月27日 优先权日:2012年6月27日
【发明者】洪梁 申请人:上海勃德生物科技有限公司