专利名称：一种用于筛选和评价抗肠道病毒71型药物的融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于筛选和评价药物的融合蛋白及其应用，特别涉及一种基于化学发光方法筛选和评价抗EV71药物的融合蛋白及其应用。属于生物技术领域。
背景技术：
肠病毒71型(enterovirus 71，EV71)是一种重要的神经感染性肠病毒，目前尚没有有效地治疗方法和疫苗。在亚太地区以及全世界范围均有关于EV71病毒感染相关的传染病爆发的报导(AbuBakar, S. , et al. . Enterovirus71 outbreak, Brunei. Emerg.Infect. Dis. 2009，15:79 - 82. )。EV71感染主要会造成儿童的皮疹，被称为手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD) 然而，EV71急性感染还会造成严重的神经性疾病 以及极高的死亡率。尤其是五岁以下儿童被EV71感染后会伴随神经并发症，包括无菌性脑膜炎、脑干和/或小脑脑炎，以及急性无力肢体麻痹、心肌炎和急性致死出血性肺水月中(Brown, B. A. , M. S. Oberste, J. P. Alexander, Jr. , M. L. Kennett, and M. A. Pallansch.Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strainsisolated from1970 to 1998. J. Virol. 1999. 73:9969-9975. )DEV71属于小RNA病毒科，肠道病毒属，是一种非包膜、单正链RNA病毒，基因组RNA包含约7400个核苷酸(nucleotide，nt)。其基因组结构由5’ _UTR、3’ -UTR、开放读码框(open reading frame，0RF)三部分构成。其中ORF分为P1、P2、P3三个部分，在翻译的过程中，经过EV712A、3C蛋白酶的切割作用，Pl编码四个结构蛋白，VP1-VP4，P2编码3个非结构蛋白(2A、2B、2C)，P3编码4个非结构蛋白(3A、3B、3C、3D)(Lin, J.Y，et al. . Viral and hostproteins involved in picornavirus life cycle. J. Biomed. Sci. 2009，16:103. XEV713C蛋白酶的主要切割位点为病毒自身或者宿主细胞内Gln-Gly (Q/G)氨基酸的连接点((WengKF, Li ML, Hung C T,Shih SR. Enterovirus 71 3C protease cleaves a novel targetCstF-64 and inhibits cellular polyadenylation. PLoS Pathog. 2009，5(9):1-13.)。目前观察和检测EV71的方法除了传统的病毒培养鉴定法外，主要是RT-PCR和免疫学方法，但这些方法操作上均比较复杂，且无法直接观察到细胞或组织中病毒的变化情况，尤其是EV71在体内的感染情况，缺乏理想的评价体系，使得药物抗EV71的作用效果难以作出评估，极大的延缓了药物的研发和筛选，因而建立一种理想的抗EV71药物的筛选评价体系迫在眉睫。本发明的目的是针对现有技术的不足，提供通过化学发光观察并检测EV71感染情况的方法，可快速、有效、简便地观察并检测到EV71的感染，为筛选抗EV71药物提供了优良的平台。
发明内容
本发明的目的在于通过EV713C蛋白酶对底物的切割，使重组融合蛋白中的Fluc的N段和C段紧密结合，使其在特异底物作用下发光，从而监测EV71的复制水平，进而提供了一种用于筛选和评价抗EV71药物的融合蛋白。Peptide A (pepA)和peptide B (pepB)是两段会发生高亲和性结合的多月太(Thormeyer D,Ammerpohl O,Larsson O, et al.Characterization of IacZcomplementation deletions using membrane receptor dimerization. Biotechniques2003,34(2) :346-350, 352-355.)。本发明中将 Fluc 的 N 段(Nluc)和 C 段(Clue)分别与 p印A和P印B结合，中间以EV713C蛋白酶在CstF-64蛋白中的切割位点连接，此时Fluc的活性由于 Nluc 与 Cluc 的分离而受到抑制(Weng KF, Li ML, Hung CT, Shih SR. Enterovirus 71 3Cprotease cleaves a novel target CstF-64 and inhibits cellular polyadenylation.PLoS Pathog. 2009，5(9) :el000593.)。当切割位点被3C蛋白酶切割，pepA与pepB发生高亲和性结合，诱使Nluc与Cluc结合从而恢复Fluc的活性并发光。 本发明的一种用于筛选和评价抗肠道病毒71型药物的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白含有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a) SEQ ID No 1所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID No. I所示的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或者添加仍具有评价EV713C蛋白酶活性作用的氨基酸序列。在本发明中，优选的，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:l所示。本发明还提供了编码所述的融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列含有以下(a)、(b)或(C)所示的核苷酸序列(a) SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；或(b)编码SEQ ID No 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(c)与SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且其编码的蛋白质具有评价EV713C蛋白酶活性作用的核苷酸序列。在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。进一步的，本发明还提供了一种重组表达载体，其特征在于含有以上任一所述的核苷酸序列。在本发明中，优选的,所述的重组表达载体为双突光报告载体，其由以下方法构建得到( I)将编码荧光素酶的N段与C段的核苷酸序列分别与编码两个可紧密结合的小分子多肽P印A与P印B的核苷酸序列之一连接，得到的两个片段由编码EV713C蛋白酶作用底物的核苷酸片段相连，得到融合基因；(2)将此融合基因插入真核表达载体P⑶NA3. I (+)中，建立了可用于指示EV713C蛋白酶活性的表达载体；(3)将N端和C端分别带有巨细胞病毒(CMV)启动子和猴空泡病毒40多聚腺苷酸尾(SV40 polyA tail)的绿色荧光蛋白(EGFP)，称为CMV-EGFP-SV40片段，反向插入步骤
(2)得到的真核表达载体中，得到所述的双荧光报告载体。更优选的，所述的双荧光报告载体为pANluc ( Δ Q/G)BCluc-EGFP,其核苷酸序列如 SEQ ID No. 4 所示。更进一步的，本发明还提供了一种宿主菌，其特征在于含有以上任一所述的重组表达载体。再进一步，本发明提供了所述的融合蛋白在制备指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的试剂或在筛选和评价抗肠道病毒71型药物中的应用。所述的核苷酸序列在制备指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的试剂或在筛选和评价抗肠道病毒71型药物中的应用。为达到上述目的，本发明采用了以下技术措施(I)构建融合蛋白ANluc ( Δ Q/G)BCluc-EGFP基因的真核表达载体；(2)观察到融合蛋白ANluc ( Λ Q/G)BCluc-EGFP可有效的在细胞中表达；(3)在细胞中共转染表达融合蛋白ANluc ( Λ Q/G)BCluc-EGFP及EGFP-3C蛋白的 真核表达载体；(4)检测表达融合蛋白ANluc( Λ Q/G)BCluc-EGFP及EGFP-3C蛋白的细胞中荧光素酶的活性；(5)表达融合蛋白ANluc(AQ/G)BCluc-EGFP的细胞中感染EV71 ；(6)检测表达融合蛋白ANluc ( Δ Q/G)BCluc-EGFP的细胞中感染EV71后荧光素酶的活性。本发明成功构建了将两个可紧密结合的小分子多肽P印A和P印B分别与Fluc N端和C端片段结合，中间由EV713C蛋白酶作用底物相连的融合基因的真核表达载体。将此载体转染至EV71易感细胞(vero细胞)，进一步感染EV71后，在FLuc底物作用下可检测到荧光素酶的表达，进而提供了一种用于筛选和评价抗EV71药物的融合蛋白。本发明尚属首创，采用分片段萤火虫荧光素酶策略，将编码荧光素酶的N段与C段的核苷酸序列分别与两个可紧密结合的小分子多肽PepA与pepB的核苷酸序列连接，中间由编码EV713C蛋白酶作用底物的核苷酸片段相连，得到融合基因，然后将此融合基因插入真核表达载体P⑶NA3. 1(+)，建立了可用于指示EV713C蛋白酶活性的表达载体pANluc ( Δ Q/G) BCluc0另外将N端和C端分别带有巨细胞病毒(CMV)启动子和猴空泡病毒40多聚腺苷酸尾(SV40polyAtail)的绿色荧光蛋白(EGFP)，以下称CMV-EGFP-SV40片段，反向插入上述真核表达载体中，可以在细胞中表达ANluc ( Δ Q/G) BCluc及EGFP，形成双荧光报告载体(指示载体)pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP。从而可通过观察绿色荧光的表达情况来指示融合蛋白ANluc ( Λ Q/G)BCluc的表达。表达载体在细胞内表达产生融合蛋白，在有EV713C蛋白酶共表达的情况下，在Λ Q/G处发生切割作用，通过P印A和p印B的相互作用，带动N端和C端的荧光素酶互补结合，形成完整的荧光素酶，通过测定荧光素酶便可反映出EV713C蛋白酶的活性，如图I所示，从而评价EV71复制情况。本发明提供的指示载体，不仅可简单、快速、灵敏而且可以定量指示EV713C蛋白酶活性，代表EV71的复制水平。在抗EV71药物存在的条件下，利用上述指示载体转染含有EV71的细胞，收集细胞样品，检测细胞内荧光素酶的表达量，以此测定细胞内EV71复制及表达的抑制率，得到对EV71抑制效果的评价，具有较高的实际应用价值，在医学领域具有广阔的应用前景。所述两个小分子多肽pepA和pepB为可紧密结合且不影响细胞功能的蛋白分子；所述3C蛋白酶作用底物为Q/G的连接点。所述指示载体可在体外细胞水平表达，或通过转基因的方式在动物体内表达。具体来讲，所述3C蛋白酶作用底物为Q/G的连接点的融合基因可命名为ANluc-Q/G-BCluc，含有下述核苷酸序列之一I)序列表中SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；2)编码序列表中的SEQ ID No. I所示的氨基酸序列的核苷酸序列；3)与序列表中SEQ ID No. 2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且其编码的蛋白仍具有评价EV713C蛋白酶活性作用的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID No. 2由1866个碱基组成，其编码序列为自5’端第I位碱基开始编码序列表中SEQ ID No. I的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第I位碱基编码p印A，自5’端第64位碱基编码N端的萤火虫荧光素酶片段，自5’端第1321位碱基编码Q/G切割位点，自5’端第1351位碱基编码pepB，自5’端第1414位碱基编码C端萤火虫荧光素酶 片段。上述融合基因ANluc-Q/G-BCluc编码的融合蛋白，含有下述氨基酸残基序列之I)序列表中的 SEQ ID No. I ；2)将序列表中SEQ ID No. I的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或者添加并具有评价EV713C蛋白酶活性作用的蛋白质。序列表中的SEQ ID No. I由621个氨基酸残基组成，自氨基端第I位氨基酸残基为pepA,自氨基端第22位氨基酸残基为N端的萤火虫突光素酶片段，自氨基端第440位氨基酸残基为Q/G切割为点，自氨基端第453位氨基酸残基为P印B，自氨基端第472位氨基酸残基为C端的萤火虫荧光素酶片段。所述指示载体中反向插入的CMV-EGFP-SV40片段，如序列表中的SEQ ID No. 3所示。序列表中的SEQ ID No. 3由1557个碱基组成，起编码序列为自5’端第I位碱基开始编码CVM启动子，自5’端第597位碱基编码EGFP片段，自5’端第1470位碱基编码SV40多聚A尾。由上述融合基因插入真核表达载体构建而成的用于评价EV713C蛋白酶活性的指示载体也是本发明所要保护的。具体的，所述指示载体是将融合基因ANluc-Q/G-BCluc插入真核表达载体PCDNA3. l(+)-EGFP形成的，命名为pANluc ( Λ Q/G) BCluc-EGFP，其核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID No. 4所示。应用本发明所述的融合蛋白指示系统评价和筛选抗EV71药物具有以下优点I)可在真核细胞内表达绿色荧光蛋白，便于在体外直接观察、控制指示载体的表达效率；2)通过观察荧光素酶活性有效且便捷的显示EV71在体外或体内的感染情况；3)在有抗EV71药物存在的情况下，通过荧光素酶活性的变化来筛选和评价抗EV71药物的效果，操作简单，观察直观、方便；4)真核细胞中不表达荧光素酶，因此在观察及检测指示载体时，无非特异性及自发突光的影响。
图I是ANluc-Q/G-BCluc融合蛋白作用机制图；图2是指示载体ANluc (Q/G) BCluc-EGFP构建策略；图3是IVIS系统观察EV713C蛋白对融合蛋白的切割作用；
图4是IVIS系统观察EV71对融合蛋白的切割作用；图5是IVIS系统观察IFN- α与GW5074对EV71复制的抑制作用；图6是IVIS系统观察指示载体在体内对EV71感染的指示作用。
具体实施例方式抗EV71药物的筛选和评价目前没有一种很理想和直接的方法。本发明通过设计一种融合蛋白作为荧光检测的指示载体，能通过检测荧光素酶的表达量来得到EV71复制情况，在抗EV71药物存在的情况下，可应用于筛选和评价抗EV71药物。本发明融合蛋白的设计，主要采用分片端萤火虫荧光素酶策略，将两段荧光素酶 分别与两个可紧密结合的小分子多肽PepA和pepB结合，并利用Q/G是3C蛋白酶作用底物的特性，将底物片段Q/G插在两段萤火虫荧光素酶中间。再将该融合基因插入真核表达载体pCDNA3. I (+)，建立可用于指示3C蛋白酶活性的表达载体ANluc ( Λ Q/G) BCluc0ANluc ( Δ Q/G) BCluc表达载体在细胞内表达产生融合蛋白，在有3C蛋白酶共表达的情况下，在Q/G处发生切割作用，通过pepA和pepB的相互作用，带动突光素酶N端和C端互补结合，从而形成完整的荧光素酶，通过测定荧光素酶活性便可反映出EV71的复制情况(如图1)，在有抗EV71药物存在的情况下，可用于筛选和评价抗EV71药物。同时在真核表达载体中反向插入的EGFP片段可通过观察绿色荧光的表达情况来指示其在细胞中的转染效率。下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例I融合蛋白ANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP真核表达载体的构建I. lpCDNA3. I (+) -EGFP 质粒平台的构建首先将质粒pEGFP-Nl (购自Clontech公司，美国)中多克隆位点去掉构建质粒pEGFP-Nl’，然后扩增CMV-EGFP-SV40片段，并将该片段反向插入pCDNA3. I (+)(购自Invitrogen公司，美国)的多克隆位点，构建载体质粒pCDNA3. I (+)-EGFP。根据EGFP (Genebank号GI1377911)的cDNA序列设计PCR扩增EGFP基因片段的引物序列如下PI (上游引物)5，-ATATATGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ’P2 (下游引物)5’ -ATATAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’扩增CMV-EGFP-SV40片段的引物序列如下P3 (上游引物)5， -GCGCGCTCGAGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC-3，P4 (下游引物)5’ -GCCGGGAATTCGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTG-3’以pEGFP-Nl为模板，使用引物P1/P2扩增EGFP片段。DNA聚合酶为primeSTARDNA Polymerase (购自日本 TaKaRa)。PCR 反应如下95°C IOmin,95°C 45s，60°C 50s，72°C 45s 共 30 个循环，再 72°C充分延伸5min。胶回收纯化EGFP片段，经限制性内切酶Nhe I和Not I双酶切，与同样经过Nhe I和Not I双酶切的质粒pEGFP-Nl连接，得到载体质粒pEGFP-Nl ’。
应用引物P3/P4，以pEGFP-Nl’为模板，扩增CMV-EGFP-SV40片段，DNA聚合酶为primeSTAR DNA Polymerase (购自日本 TaKaRa)。PCR 反应如下95°C IOmin,95°C 45s，60°C 50s，72°C 45s 共 30 个循环，再 72°C充分延伸5min。胶回收纯化后的CMV-EGFP-SV40片段(序列如SEQ ID No. 3)经过Xho I和EcoR I双酶切后，与经过Xho I和EcoR I双酶切的质粒pCDNA3. I (+)，利用T4DNALigase连接，得到载体质粒 PCDNA3. I (+) -EGFP。I. 2 指示载体 pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP 的构建I. 2. IpANluc ( Δ Q/G) BCluc 基因片段的制备根据Fluc (Genebank 号GI76364278)的 cDNA 序列设计 PCR 扩增带有 pepA 和EV713C蛋白酶裂解底物的N端萤火虫荧光素酶片段(P印ANluc-Q/G)引物，序列如下 P5 (上游引物)5， -CCCAAGCTTATGAACGAAGCATATGTACATGACGGTCCTGTACGCTCACTGAACAGCGGCCGCAGAGGAGGAGAAGATGCCAAAAACATT-3，P6 (下游引物)5， -GCTTCCTTTCGTGCCTTGCCTCCTCCACCCTGAATACTTGCTCCTTGCATTACTGCGCCTCCTCCGCCGTCCTTGTCGATGAGAGCG-3，扩增带有P印B的C端萤火虫荧光素酶片段(P印BCluc)引物序列如下P7 (上游引物)5， -GTATTCAGGGTGGAGGAGGCAAGGCACGAAAGGAAGCAGAACTGGCAGCAGCAACTGCAGAACAGAGCGGCCGCAGATACGTTAACAACCCCGA-3，P8 (下游引物)5’ -TATAGGATCCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTCTTGGCCTT-3’以含有萤火虫突光素酶基因的质粒pGL4. 17 (购自Promega公司，美国)为模板，应用上述引物PCR扩增P印ANluc-Q/G、pepBCluc基因片段，DNA聚合酶为primeSTAR DNAPolymerase (购自日本 TaKaRa)。PCR 反应如下95°C IOmin, 95°C 45s，60°C 50s, 72°C 45s 共 30 个循环，再 72°C充分延伸5min。胶回收纯化P印ANluc-Q/G、pepBCluc基因片段，以纯化后的两个片段为模板，用引物 P5/P8 overlap PCR 扩增 ANluc-Q/G-BCluc 基因片段，DNA 聚合酶为 primeSTAR DNAPolymerase (购自日本 TaKaRa)。Overlap PCR 反应如下95°C IOmin0 95V 45s,60°C 50s, 72°C 45s，共 10 个循环，后向 PCR混合液加入上下游引物(P5 和 P8)，95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s，共 20个循环，再72 °C充分延伸5min。胶回收纯化ANluc-Q/G-BCluc片段，经过Hind III和BamH I双酶切，回收后与Hind III和BamH I双酶切的载体pCDNA3. I (+) -EGFP连接，得到指示载体pANluc ( Δ Q/G)BCluc-EGFP。本实施例得到的指示载体pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP序列见序列表中SEQNo. 4,其中ANluc-Q/G-BCluc基因编码具有序列表中SEQ No. I所示的氨基酸序列的蛋白质，自5’端第I位碱基编码pepA，自5’端第22位碱基编码N端的萤火虫荧光素酶片段，自5’端第440位碱基编码3C的切割位点Q/G，自5’端第453位碱基编码pepB，自5’端第472位碱基编码C端的萤火虫荧光素酶片段。具体操作中，所有限制性内切酶及连接酶均购自日本TaKaRa公司，双酶切反应条件为37°C 4h，酶切产物的连接使用日本TaKaRa公司的T4DNA连接酶，按目的片段与各自载体5:1的质量比建立连接体系，混匀后，4°C过夜连接，连接酶为T4DNA Ligase0 PCR及酶切产物经电泳胶回收试剂盒均购自TransGene公司，操作参考试剂说明书。实施例2利用细胞内转染表达EV713C蛋白的载体验证融合蛋白的作用I.载体 pEGFP-3C 的构建 I. IpEGFP-Cl质粒平台的构建以pcDNA3. I ( + )(购自美国Invitrogen)作为基本质粒骨架，从pEGFP-Nl质粒(购自美国Invitrogen)上扩增出3’端带有柔性连接的EGFP核酸片段，将绿荧光蛋白EGFP基因片段插入pcDNA3. I ( + )质粒，构建pEGFP-Cl质粒平台。根据EGFP (Genebank号GI1377911)的cDNA序列设计PCR扩增3’端带有柔性连接(5，GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG3’)的EGFP基因片段的引物序列如下P9 (上游引物)5 ’ -ATATATAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3 ’PlO (下游引物)5，-GCTTTAAGCTTCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’以pEGFP-Nl质粒为模板，使用引物P9、P10扩增3’端带有柔性连接的EGFP片段。PCR 反应条件为95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s，共 30 个循环，再 72°C充分延伸5min。DNA 聚合酶为 primeSTAR DNA Polymerase (购自日本 TaKaRa)。胶回收 EGFP 片段进行Nhe I/Hind III双酶切，并与同样经过Nhe Ι/HindIII双酶切的载体质粒pCDNA3. I (+)连接，得到平台质粒pEGFP-Cl。I. I. 2pEGFP-3C 的构建将EV713C蛋白编码基因插入pEGFP_Cl柔性连接片段的3’端，构建成为载体质粒PEGFP-3C。根据 EV713C(Genebank 号GI226510739)的 cDNA 序列设计 PCR 扩增 EV713C 的引物序列如下Pll (上游引物)5’ -ACAAGGGAAGCTTGGCCCTAGCCTTGATTTTGCTCT-3’P12 (下游引物)5 ’ -GCGCGCTCTAGATTGTTCACTAGCAAAGTAACTC-3 ’以质粒PEV71 (姚昕，等。肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析。中华流行病学杂志。2009,30 (7):729-732。)为模板，应用引物P11/P12扩增3C基因片段，PCR反应条件为95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s 共 30 个循环，再 72°C充分延伸 5min。将胶回收纯化得到的3C基因片段通过Hind ΙΙΙ/Xba I与经相同双酶切处理后的pEGFP-Cl连接，得到EV713C的真核表达载体pEGFP-3C。I. I. 3pEGFP-m3C 的构建将EV713C中第147个氨基酸从半胱氨酸突变为丝氨酸，使其失去切割活性(Weng KF,Li ML, Hung C T,Shih S R.Enterovirus713C protease cleavesa novel targetCstF-64 and inhibits cellular polyadenylation.PLoSPathog. 2009, 5(9) :el000593.)，并将突变后的3C蛋白编码基因(m3C)插入pEGFP-Cl柔性连接片段的3’端，构建成为载体质粒pEGFP-m3C。其中扩增3C编码基因上半段的引物序列如下Pll (上游引物)5’ -ACAAGGGAAGCTTGGCCCTAGCCTTGATTTTGCTCT-3，P13 (下游引物)5，-TCACCACTCCTCCCGACTGTCCT-3，扩增3C编码基因下半段的引物序列如下P14 (上游引物)5’ -CTAAAGCAGGACAGTCGGGAGGA-3’P12 (下游引物)5 ’ -GCGCGCTCTAGATTGTTCACTAGCAAAGTAACTC-3 ’
以质粒pEV71为模板，应用引物P11/P13扩增3C基因上半段，PCR反应条件为95°C IOmin,95°C 45s,60°C 50s, 72°C 45s 共 30 个循环，再 72°C充分延伸 5min。应用引物P14/P12 扩增 3C 基因下半段，PCR 反应条件为95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s 共30个循环，再72°C充分延伸5min。应用引物P11/P12将3C基因的上半段与下半段组合成完整的m3C基因片段，PCR反应条件为95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s共30个循环，再72°C充分延伸5min。将胶回收纯化得到的m3C基因片段通过Hind ΙΙΙ/Xba I与经相同双酶切处理后的pEGFP-Cl连接，得到EV713C的真核表达载体pEGFP_m3C。2.利用细胞内转染PEGFP-3C验证指示系统2. I真核细胞转染实验将非洲绿猴肾细胞Vero细胞(购自美国ATCC)以5X IO4个/孔的密度铺于24孔板内，置于37°C、5%C02的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85%-90%时，将 O. 8 μ g pEGFP-Cl、pEGFP-3C 与 pEGFP_m3C 分别与 O. 8 μ gpANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP 共转染至Vero细胞内，所用的转染试剂为Lipofectamine2000 (购自美国Invitrogen),转染操作参考试剂说明书。2. 2培养24h后检测荧光素酶表达水平试验结果见图3，从试验结果可见，结果发现共转染pEGFP-3C与pANluc ( Λ Q/G)BCluc-EGFP组，Fluc活性要明显高于对照组和m3C。说明该指示系统可以用来指示3C蛋白酶活性。应用RT-PCR的方法及引物P11/P12从转染后细胞RNA中扩增3C编码基因，发现转染了 PEGFP-3C和pEGFP-m3C的细胞中均可发现3C的RNA表达。3.利用细胞内感染EV71验证融合蛋白的作用将非洲绿猴肾细胞Vero细胞(购自美国ATCC)以5X IO4个/孔的密度铺于24孔板内，置于37°C、5%C02的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85%-90%时，将O. 8 μ g指示载体pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP转染至Vero细胞后24h，用MOI分别为I、O. 1,0. 01,0. 001和O的EV71国际标准株(肠道病毒71型(EV71)ICR乳鼠动物模型的建立，刘娟等，《军事医学》2011年第11期，现该EV71毒株保存在哈尔滨医科大学。)攻击Vero细胞，5h后应用细胞活体荧光成像系统检测细胞中荧光素酶活性。结果如图4所示,感染EV71的Vero细胞中Fluc的活性明显高于未感染组，同时Fluc的活性随EV71感染量的递减而降低，说明该指示系统可以用来指示EV71感染的水平。4.检测IFN- α与GW5074对EV71复制的抑制作用
将非洲绿猴肾细胞Vero细胞(购自美国ATCC)以5X IO4个/孔的密度铺于24孔板内，置于37°C、5%C02的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85%-90%时，将O. 8 μ g指示载体pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP转染至Vero细胞后24h，用MOI=I的EV71 攻击 Vero 细胞，Ih 后分别应用浓度为 0、20、100、200、500IU/mL 和 0,2. 5、5、10、20 μ M的IFN-α和GW5074作用。4h后应用细胞活体荧光成像检测细胞中荧光素酶活性。结果如图5所示，随着药物浓度的增高，细胞中Fluc的活性有所降低，说明IFN- α和GW5074对于EV71的复制均有抑制作用，而此指示系统可以用于抗EV71药物的筛选。5.体内验证融合蛋白对于EV71复制的指示作用将出生一天的ICR小鼠分为感染组和对照组，其中感染组小鼠颅内注射20 μ LI X 107pfu/mL的EV71，对照组颅内注射20 μ L PBS。感染后24h，向感染组和对照组均颅内注射20 μ g指示质粒。感染后2天和6天，分别应用活体荧光成像系统观察感染组 与对照组感染部位荧光表达情况，发现感染组小鼠头部Fluc活性均比对照组升高，同时观察到感染组小鼠体重明显减轻同时出现明显的EV71感染所致的神经症状，如后肢麻痹及皮疹等现象(图6)，说明该指示系统可以用来指示体内EV71感染水平。以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种用于筛选和评价抗肠道病毒71型药物的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白含有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列 (a)SEQ ID No 1所示的氨基酸序列；或 (b)将SEQID No. I所示的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或者添加仍具有评价EV713C蛋白酶活性作用的氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo 1所示。
3.编码权利要求I或2所述的融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列含有以下(a)、(b)或(C)所示的核苷酸序列 (a)SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；或 (b)编码SEQID No :1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或 (c)与SEQID No. 2所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且其编码的蛋白质具有评价EV713C蛋白酶活性作用的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所/Jn o
5.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求3或4所述的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的重组表达载体,其特征在于所述的重组表达载体为双突光报告载体，其由以下方法构建得到 (1)将编码荧光素酶的N段与C段的核苷酸序列分别与编码两个可紧密结合的小分子多肽p印A与p印B的核苷酸序列之一连接，得到的两个片段由编码EV713C蛋白酶作用底物的核苷酸片段相连，得到融合基因； (2)将此融合基因插入真核表达载体p⑶NA3.I (+)中，建立了可用于指示EV713C蛋白酶活性的表达载体； (3)将N端和C端分别带有巨细胞病毒(CMV)启动子和猴空泡病毒40多聚腺苷酸尾(SV40polyA tail)的绿色荧光蛋白(EGFP)，称为CMV-EGFP-SV40片段，反向插入步骤(2)得到的真核表达载体中，得到所述的双荧光报告载体。
7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于所述的双突光报告载体为pANluc( A Q/G)BCluc-EGFP，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 4 所示。
8.—种宿主菌,其特征在于含有权利要求5-7任一项所述的重组表达载体。
9.权利要求I或2所述的融合蛋白在制备指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的试剂或在筛选和评价抗肠道病毒71型药物中的应用。
10.权利要求3或4所述的核苷酸序列在制备指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的试剂或在筛选和评价抗肠道病毒71型药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于筛选和评价抗肠道病毒71型(EV71)药物的融合蛋白及其应用，所述融合蛋白是以萤火虫荧光素酶(Fluc)为报告基因，将两个可紧密结合的小分子多肽pepA和pepB分别与萤火虫荧光素酶N端和C端片段结合，中间由EV713C蛋白酶作用底物相连，然后将此融合基因插入真核表达载体后表达产生。同时反向插入的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)可在体外转染的细胞中通过观察绿色荧光情况指示其转染效率。利用本发明提供的指示载体，不仅可简单、快速、灵敏地定量指示EV71的复制情况，同时可以应用于筛选和评价抗EV71药物，具有较高的实际应用价值，在医学领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/66GK102766607SQ20121025549
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者佟雷, 林乐勋, 赵文然, 郭志伟, 钟照华 申请人:哈尔滨医科大学