专利名称：一种特异性γ-谷氨酰基转移酶检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特异性Y-谷氨酰基转移酶特异性检测方法及其应用。
背景技术：
血清中的Y-谷氨酰基转移酶(GGT，EC2. 3. 2. 2)是以同工酶或多种分子形式存在的，有些GGT能与脂蛋白结合在一起，如与低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)结合，但其形成原因及生理功能尚不清楚。现有技术中，关于血清GGT总活性测定是临床常规开展的酶学检测项目，其在急性病毒性肝炎、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、肝内胆汁淤积、肝外胆道阻塞、原发性或转移性肝癌时，均有不同程度增高；但血清中GGT总活性测定特异性低，无法作为与之相关疾病的特异性检查，尤其是对于肝癌与其他肝病的鉴别诊断尚缺乏特异性的检测方法及其配套产品
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种特异性Y -谷氨酰基转移酶检测方法及其应用，是特异性针对与血清中低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白结合的Y -谷氨酰基转移酶活性，以实现用简便、快捷的方法来检测样品中肝癌及其其他严重肝病的鉴别诊断。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法，具体为通过检测以抗载脂蛋白B抗体(Apo B抗体)与低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)间形成的免疫沉淀结合物前后的血清中的Y-谷氨酰基转移酶的活性差值。作为一种优选方案，所述的抗载脂蛋白B抗体与低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)间形成的免疫沉淀结合物后的血清中的Y-谷氨酰基转移酶的活性为形成免疫结合物后经离心的上清液中的Y-谷氨酰基转移酶的活性。作为进一步优选方案，所述的检测Y-谷氨酰基转移酶的活性的方法为以L-Y-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺(3-carboxy-GGPNA)为底物且能在全自动生化分析仪上应用的连续监测法。作为更进一步优选方案，上述检测方法包括如下步骤4)测定样品血清中的总Y -谷氨酰基转移酶的活性；5)加入抗载脂蛋白B抗体液及沉淀剂，5 30分钟后，离心，取上清液，测定上清液中的Y-谷氨酰基转移酶的活性；6)计算步骤I)与步骤2)中的Y-谷氨酰基转移酶的活性差值。一种特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法的应用，是指以上述方法制备用于诊断或辅助诊断肝癌的诊断试剂或诊断试剂盒。作为一种优选方案，上述的诊断试剂或诊断试剂盒，包括抗载脂蛋白B抗体液、缓冲液、沉淀剂。
作为进一步优选方案，所述的缓冲剂为pH7. 0,30mmol/L MOPS缓冲液。作为进一步优选方案，所述的沉淀剂为30%聚乙二醇6000。与现有技术相比，本发明提供了一种简单有效的诊断或辅助诊断肝癌的诊断试剂或诊断试剂盒，实验结果表明，本发明提供的特异性检测血清LDL/VLDL-GGT活性方法可用于检测或辅助检测肝癌的诊断试剂或诊断试剂盒，平均诊断特异性可达70%以上，平均阳性预测值为90%。因此，其应用前景十分广阔。
图I为本发明提供的特异性Y-谷氨酰基转移酶检测试剂盒的结构示意图。
具体实施例方式下面结合实施例及对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。 实施例I、制备特异性Y-谷氨酰基转移酶检测试剂盒(10人份)，具体如图I所示，其中包括三管试剂，分别为抗体液⑴抗人Apo B抗体+缓冲液；缓冲液(2)pH7.0,30mmol/L MOPS ；沉淀剂(3):30%聚乙二醇 6000。A.试剂组成I)对照组(总活性组)pH7. 0，3OmmoVL MOPS 缓冲液 850 U L。2)抗体组(待测定组)含抗载脂蛋白B抗体850 U L、30%聚乙二醇6000沉淀剂420 u L。B.操作步骤(I)抗体组在离心试管内加入患者血清标本IOOii L，抗体液80 ii L，沉淀剂20 u L，37°C放置20min，离心(5500gX 5min)，取上清液在生化分析仪上测定GGT活性。(2)对照组在离心试管内加入患者血清标本100 iiL，缓冲液80ii L，沉淀剂20 u L，37°C放置20min，离心(5500gX 5min)，取上清液在生化分析仪上测定GGT活性。(3)结果计算LDL/VLDL-GGT活性(U/L)=(对照组管-抗体组管)X 2。注GGT活性测定可采用各实验室在生化分析仪上应用的方法，试剂自备。具体检测方法如下a)检测原理本法以溶解度较大的L- Y -谷氨酰-3-羧基_对硝基苯胺为底物，双甘肽为Y-谷氨酰基的受体。在GGT的催化下，谷氨酰基转移到双甘肽分子上，同时释放出黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，引起405nm 4IOnm波长处吸光度的增高。吸光度增高速率与GGT活性呈正比关系。b)检测试剂试剂成份和在反应液中的终末浓度如下pH7. 7，37°C，150mmol/L甘氨酰甘氨酸缓冲液，6mmol/L的L-Y-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺，样品体积分数I : 11。c)检测仪器参数温度37°C，波长410nm，带宽彡2nm,比色杯光径I. 0cm，孵育时间180s，延迟时间60s，监测时间180s，读数点彡6，因数1159。d)计算方法GGT(U/L) = A A/minX (106X2. 75)/(9490 X0. 25) = AA/minX 1159 (2-硝基-5-氨基苯甲酸在405nm处的摩尔吸光度为9490)2、检测性能验证DApoB抗体沉淀效果取16份血清样品，I 8号样品的LDL-C浓度范围在I. 5 10. 3mmol/L，9 16号样品的GGT活性范围在30 1950U/L，分别用抗体液沉淀后，上清液进行脂蛋白电泳。电泳结果表明，所有样品只有高密度脂蛋白(HDL)I条带，而无LDL和VLDL区带，说明该ApoB抗体能很好地沉淀血清样品中LDL和VLDL。2)沉淀时间影响取低、中、高LDL/VLDL-GGT活性样品3份，加入抗体液和沉淀剂后分别在37°C放置5、10、15、20、25、30min，结果表明，在5 30min内，沉淀效果基本一致。本实验盒选择20min为沉淀时间。 3)精密度实验取不同GGT活性的3份新鲜混合血清，GGT活性分别为52、264、875U/L，每份样品重复测定LDL/VLDL-GGT活性15次，计算批内精密度。3份血清LDL/VLDL-GGT活性的均值分别为 8. 4、29、123U/L，s 为 0. 69、I. 78,4. 38，批内 CV 为 8. 21,6. 14,3. 56%。每份样品每间隔Ih测定，每批重复3次取平均值，共测定5批，计算批间精密度。3份血清LDL/VLDL-GGT活性的均值分别为 8. 6、31、128U/L，s 为 0. 84,2. 24,6. 98，批间 CV 为 9. 77,7. 23,5. 45%。4)线性实验取一极高GGT活性的肝癌病人血清，经检测LDL/VLDL-GGT活性为587U/L，取一正常人血清经检测LDL/VLDL-GGT活性为0U/L，将二者按不同比例混合(I 9 9 1)，分别测定各混合样品的LDL-VLDL-GGT活性。结果表明，LDL-VLDL-GGT活性在0 587U/L范围内线性良好。5)参考范围，由上述线性实验结果中可知，血清中LDL/VLDL-GGT正常参考值为(10U/L。6)试剂盒临床应用结果a)标本来源患者血清150份，其中肝癌65份，肝硬化53份，慢性肝炎32份。所有临床病人均经病理检查、B超及临床确诊。体检健康者血清标本75份，其中男39名，女36名，年龄范围20 54岁，无溶血，脂血。以上血清收集后，置_30°C冰箱保存。b)各肝脏疾病组血清LDL/VLDL-GGT活性检测结果对150份肝脏疾病病人血清LDL/VLDL-GGT进行检测，具体结果见表I。表I各肝脏疾病组血清LDL/VLDL-GGT活性结果
权利要求
1.一种特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法，其特征在于通过检测以抗载脂蛋白B抗体与低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)间形成的免疫沉淀结合物前后的血清中的Y-谷氨酰基转移酶的活性差值。
2.根据权利要求I所述的特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法，其特征在于所述的抗载脂蛋白B抗体与低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)间形成的免疫沉淀结合物后的血清中的Y-谷氨酰基转移酶的活性为形成免疫结合物后经离心的上清液中的Y-谷氨酰基转移酶的活性。
3.根据权利要求I所述的特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法，其特征在于所述的检测Y-谷氨酰基转移酶的活性的方法是以L-Y-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺(3-carboxy-GGPNA)为底物且能在全自动生化分析仪上应用的连续监测法。
4.根据权利要求I所述的特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法，其特征在于所述特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法包括如下步骤 1)测定样品血清中的总Y-谷氨酰基转移酶的活性； 2)加入抗载脂蛋白B抗体液及沉淀剂，5 30分钟后，离心，取上清液，测定上清液中的Y-谷氨酰基转移酶的活性； 3)计算步骤I)与步骤2)中的Y-谷氨酰基转移酶的活性差值。
5.一种权利要求I所述特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法的应用，其特征在于是指以上述方法制备用于诊断或辅助诊断肝癌的诊断试剂或诊断试剂盒。
6.根据权利要求5所述特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法的应用，其特征在于上述的诊断试剂或诊断试剂盒，包括抗载脂蛋白B抗体液、缓冲液、沉淀剂。
7.根据权利要求6所述特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法的应用，其特征在于所述的缓冲剂为PH7. 0,30mmol/L MOPS缓冲液。
8.根据权利要求6所述特异性Y-谷氨酰基转移酶检测方法的应用，其特征在于所述的沉淀剂为30%聚乙二醇6000。
全文摘要
本发明提供了一种特异性γ-谷氨酰基转移酶检测方法，具体为通过检测以抗载脂蛋白B抗体与低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)间形成的免疫沉淀结合物前后的血清中的γ-谷氨酰基转移酶的活性差值；以及应用上述方法制备的诊断试剂或诊断试剂盒。与现有技术相比，本发明提供了一种简单有效的诊断或辅助诊断肝癌的诊断试剂或诊断试剂盒，实验结果表明，本发明提供的特异性检测血清LDL/VLDL-GGT活性方法可用于检测或辅助检测肝癌的诊断试剂或诊断试剂盒，平均诊断特异性可达70％以上，平均阳性预测值为90％。因此，其应用前景十分广阔。
文档编号C12Q1/48GK102796804SQ20121026140
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者于嘉屏 申请人:上海迪安医学检验所有限公司