专利名称：小鼠肝窦内皮细胞的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种小鼠肝细胞的提取方法，具体地指一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法。
背景技术：
肝窦内皮细胞(Liver Sinusoidal Endothelial Cells)属于肝脏中的非实质性细胞，在肝脏中起到屏障、物质代谢、超滤内吞，抗原呈递等作用。近年来国内外学者对肝窦内皮细胞分离方法进行了大量的研究，但要获得纯度高，细胞活性好，功能稳定的肝窦内皮细胞仍很困难，尤其是小鼠肝窦内皮细胞。由于小鼠品系丰富，可以更充分的满足各类研究的需要，所以获得细胞活性好的小鼠肝窦内皮细胞具有重要意义。目前，小鼠肝窦内皮细胞采用以下三种提取方法两步原位灌流结合密度梯度离·心法、机械分离结合酶消化及密度离心法、免疫磁珠分选及流式分选法。两步原位灌流结合密度梯度离心法主要集中于大鼠，由于技术条件的限制，较少应用于小鼠的肝窦内皮细胞分离，且该方法无法将肝窦内皮细胞和枯否细胞(kupffer cells)分离，导致最终获得的细胞纯度受到影响；机械分离结合酶消化及密度离心法对细胞损伤过大，而且会造成组织块表面消化过度，内部消化不足；免疫磁珠分选及流式分选法所得到的小鼠肝窦内皮细胞虽然纯度高，但是由于肝窦内皮细胞缺乏特异性的表面标志物，使得细胞获得量少，且细胞分选前必须加上某些化学标记有可能造成细胞的分化或凋亡，同时其昂贵的仪器及试剂费用限制了其在各个实验室的应用。综上所述，现有的三种小鼠肝窦内皮细胞提取方法均有各自的缺陷，现有技术尚未报道有合适的针对小鼠的肝窦内皮细胞提取方法。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术针对小鼠肝窦内皮细胞分离时易产生机械损伤，化学预处理导致的细胞活力差，状态下降及纯度不够等缺陷，提供一种能够较好的保持细胞完整性和生化活性，且一次提取的肝窦内皮细胞数量较多，纯度高小鼠肝窦内皮细胞的提取方法。为实现上述目的，本发明所设计的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，包括以下步骤I)选取小鼠尾静脉注射氯化钆溶液，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比为l(T20mg/25g，连续注射两日后进行手术,术前一天禁食；2)消毒器械及动物工作台，36 38°C预温D_hanks液，1640培养液及胶原酶IV溶液；3 )选取小鼠腹腔注射戊巴比妥钠及肝素钠，戊巴比妥钠的日注射量和小鼠体重之比为4(Tl00mg/kg，肝素钠40 60U/只；4)待小鼠完全麻醉后固定于动物手术台，消毒小鼠腹部，无菌纱布铺巾防止污染；5)取正中切口进腹，撑开腹腔，将肠管拨向左下腹，暴露门静脉及下腔静脉；6)连接五十毫升注射器、灌注泵、延长管及静脉留置针，开启灌注泵，让预温的D-hanks液充满延长管及静脉留置针，排净空气；7)静脉留置针穿刺门静脉，成功后拔出针芯，双重丝线结扎，D-hanks液被泵入门静脉，观察到肝脏颜色变成土黄色时，剪开下腔静脉，调整灌流速度为30ml/h ；8)依次剪开肝脏周围韧带及膈肌，将肝脏迅速完整的分离下来，勿损伤肝脏，将其置于预先放置了 36 38°C D-hanks液的培养皿中，持续D-hanks液灌注25 40min ；9)然后，将灌流液体换为预温的胶原酶IV溶液，调整灌流速度为15 17ml/h，灌流2(T30min后，拔出静脉留置针，将肝脏置于胶原酶IV溶液中于37°C温箱放置l(T20min ；
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10)从温箱中取出肝脏，将肝脏置于100目滤网上，减去胆囊及与肝脏相连的膈肌、韧带、肝门区血管，无损伤镊剥离肝包膜，挑去其中脉管系统，用预温的1640培养液反复冲洗将细胞滤过滤网；11)过滤后的细胞悬液低速50g离心3min，使肝脏实质性细胞沉淀，取上清液以800g离心IOmin后，取细胞沉淀以3毫升1640培养液重悬，得细胞悬液备用；12)在离心管中，分别铺3ml的50%percoll溶液，3ml的25%percoll溶液，及3ml细胞悬液，常温离心1200g，2(T40min ；13)取两层percoll液体之间的细胞层，用1640培养液重悬混匀后，2000rmp离心lOmin，去掉上清，所得沉淀用1640培养液重悬并同样条件再离心一次，取沉淀得到待培养细胞，在体积百分比浓度为20%的胎牛血清中培养；14)观察待培养细胞的贴壁状态，待细胞贴壁I小时后，取未贴壁细胞悬液于新容器中培养，12小时后换液，去除未贴壁细胞及死亡细胞，即为肝窦内皮细胞；其中，所述胶原酶IV溶液的质量浓度为O. 05、. 1%，优选为O. 05%。所述氯化礼溶液的浓度为9(Tl20mg/ml,优选为100mg/ml。所述氯化钆溶液的配制方法为按照每Iml无内毒素O. IM磷酸盐缓冲液或每Iml生理盐水溶解9(Tl20mg氯化钆的比例配制，并过滤除菌。所述步骤I)中，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比优选为10mg/25g。所述25%percoll溶液和50%percoll溶液的配制方法为percoll原液高压消毒，然后，9份percoll原液混合I份质量浓度为8. 5%的生理盐水，混匀后为100%perCOll溶液；取I. 5ml的100%percoll溶液混合I. 5ml的生理盐水，配制为50%percoll溶液；取0. 75ml的100%percoll溶液混合2. 25ml的生理盐水，配制为25%percoll溶液。所述质量浓度为0. 05、. 1%的胶原酶IV溶液的配制方法为每200ml的D-hanks液中溶解IOOlOOmg胶原酶IV，4°C搅拌过夜，过滤除菌后，分装保存。本发明提供的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法是利用氯化钆注射清除枯否细胞，结合两步灌流、差速离心、percoll离心、差速贴壁的来实现肝窦内皮细胞的分离。和现有技术相比，本发明采用小鼠预注射氯化钆溶液两天，以促进KC细胞的凋亡，同时保护肝窦内皮细胞在分离过程中窗孔结构的完整和活性的稳定，从而使提取的细胞纯度明显升高，活性得到保持；选用两步灌注法保证肝窦内血液充分清除，预防了酶消化不完全及机械损伤。本发明的有益效果所提供的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，简单易行、细胞纯度高、获得率高，并在体外培养保留完整的结构和功能活性，可用于生化及免疫学。此外，本发明方法使用实验室常规仪器，成本低可在大部分实验室推广。
图I为以本发明方法分离的肝窦内皮细胞倒置显微镜照片。图2为图I中肝窦内皮细胞的扫描电镜图片。图3为图I中肝窦内皮细胞的免疫荧光图片。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例·针对小鼠提取肝窦内皮细胞的步骤为I)选取正常雄性KM小鼠，周龄约9 10周，体重2(T25g之间，尾静脉注射氯化钆溶液O. Γ0. 2ml (约IOmg 20mg/25g)连续两日后进行手术，术前一天禁食，不限水；2)消毒器械及动物工作台，紫外线预照射实验台I小时,37°C预温D-hanks, 1640培养液，及质量浓度为O. 05%胶原酶IV溶液；3)取小鼠一只腹腔注射O. Iml质量浓度为1% (10mg/ml)的戊巴比妥钠溶液，约40mg/kg，及O. 2ml浓度为200U/ml的肝素钠溶液，约40U/只；4)待小鼠完全麻醉后固定于动物手术台,用质量浓度为75%酒精消毒小鼠腹部三遍，裁剪好无菌纱布铺巾防止污染；5)取正中切口进腹，用开睑器撑开腹腔，蚊式止血钳提起剑突固定，充分暴露腹腔，滴加少许生理盐水，防止腹腔干燥；将肠管拨向左下腹，暴露门静脉及下腔静脉；6)连接五十毫升注射器、灌注泵、延长管及22号静脉留置针，开启灌注泵，让37°C预温的D-hanks液充满延长管及静脉留置针，调整灌注速度为28 32ml/h，排净空气；7)门静脉下方留置丝线2根，静脉留置针穿刺门静脉，成功后拔出针芯，双重丝线结扎，D-hanks液被泵入门静脉，观察到肝脏颜色变成土黄色时，剪开下腔静脉，调整灌流速度为 30ml/h ；8)依次剪开肝脏周围韧带及膈肌，将肝脏迅速完整的分离下来，勿损伤肝脏，将其置于预先放置了 37°C预温D-hanks液的培养皿中，持续D-hanks液灌注30min ；9)然后，将灌流液替换为37°C预温的胶原酶IV溶液，调整灌流速度为15ml/h，灌流25min后，拔出静脉留置针，将肝脏置于胶原酶IV溶液中于37°C温箱放置IOmin保证充分消化；10)从温箱中取出肝脏，将肝脏置于100目滤网上，减去胆囊及与肝脏相连的膈肌、韧带、肝门区血管，无损伤镊剥离肝包膜，挑去其中脉管系统，用预温的1640培养液反复冲洗将细胞滤过滤网；11)过滤后的细胞悬液低速50g离心3min，使肝脏实质性细胞沉淀，取上清液以800g离心IOmin后，取细胞沉淀以3毫升1640培养液重悬，得细胞悬液备用；12)在15毫升离心管中，先铺3ml的50%perColl，将管壁倾斜45度角，沿管壁小心加入3ml的25%percoll,细胞悬液3ml置于最上方,加入方法同前,常温离心1200g,2(T40min，离心过程中使离心机加速度及减速度为最低；13)小心弃去离心管中的上层细胞，取两层percoll液体之间的细胞层，用1640培养液IOml重悬混勻后,2000rmp离心IOmin,去掉上清,所得沉淀用1640培养液重悬并同样条件再离心一次，取沉淀得到待培养细胞，在体积百分比浓度为20%的胎牛血清中培养；14)观察待培养细胞的贴壁状态，待细胞贴壁I小时后，取未贴壁细胞悬液于目标容器培养，12小时后换液，去除未贴壁细胞及死亡细胞，即为肝窦内皮细胞。其中，上述氯化钆溶液的配制方法为按照每Iml无内毒素O. IM磷酸盐缓冲液(PBS)溶解IOOmg氯化钆的比例配制，并过滤除菌。25%percoll溶液和50%percoll溶液的配制方法为percoll原液高压消毒。9份percoll原液+1份质量浓度为8. 5%的生理盐水，混匀后为100%percoll溶·液；I. 5ml 的 100%percoll 溶液 +1. 5ml 的生理盐水，配制为 50%percoll 溶液；O. 75ml 的 100%percoll 溶液 +2. 25ml 的生理盐水，配制为 25%percoll 溶液。质量浓度为O. 05%的胶原酶IV溶液的配制方法为100mg胶原酶IV (sigma)加入200ml的D-hanks液中，4°C搅拌过夜，过滤除菌后按照每次用量分装保存，每只小鼠用量约 15ml。上述D-hanks液为三蒸水配制，配制方法为KC1 0. 4g, KH2PO4 0. 06g, NaCl
8.Og, NaHCO3 :0. 35g，Na2HPO4 · 7H20 :0. 06g，溶解于三蒸水中定容至IL后，高压灭菌密封保存。1640培养液配制方法为1640干粉(GIBICO) I包+HEPES (AMERSCO) 3g+碳酸氢钠2g，溶解后，定容至1L，过滤除菌，分装为IOOml每瓶冰箱保存。体积百分比浓度为20%的胎牛血清配制方法为胎牛血清20ml+1640培养液80ml混匀。实验检测结果实验例I :显微镜观察将获得的小鼠肝窦内皮细胞倒置显微镜观察，低倍镜下可见活细胞呈光亮圆形，饱满，透光度好，胞核清晰(图1)，评价每只小鼠可以获得约2X106个肝窦内皮细胞。 实验例2 :扫描电镜(SEM)观察将实施例I得到的肝窦内皮细胞接种于预铺了鼠尾胶原I型的细胞爬片上，戊二醛4°C固定过夜，309Γ100%酒精梯度脱水，梯度为10%，每个梯度约2h，脱水结束后真空干燥喷金上环境扫描电镜检测(图2)，可见细胞呈梭形，核大，四周薄，可见大小不一的窗孔结构。实验例3 :免疫荧光(IF)鉴定I)细胞爬片上滴加I型鼠尾胶原后晾干备用；2)将肝窦内皮细胞(LSEC)接种于细胞爬片上；3)细胞用PBS洗涤5min X 3次；4) 4%多聚甲醛4°C固定I小时；5 ) PBS 洗涤 5min X I 次；6) O. 05% Triton-100 于 4°C破膜 IOmin ；
7) 5%BSA 封闭 4°C I 小时;8) cd31抗体I : 50，湿盒中4°C过夜；9 ) PBS 洗涤 5min X 3 次；10) FITC标记荧光二抗4°C湿盒中孵育I小时；11) DAPI 20ul滴于爬片表面染核IOmin ；12)卩85洗涤511^11\3次；13)甘油封片剂封片，荧光显微镜照相。结果见图3，可见细胞呈梭形，核大，抗体染色集中在胞膜上。
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根据以上实施例及实验例，一只小鼠平均提取肝窦内皮细胞约2 X IO6,免疫荧光及扫描电镜鉴定为肝窦内皮细胞且免疫荧光观察到细胞纯度95%以上。说明本发明分离的肝窦内皮细胞纯度高，细胞损伤小，获得率高，并在一定时间内保持肝窦内皮细胞的结构和功能，用于生化及免疫学研究，有利于在一般实验室推广。以上所揭露的仅为本发明的优选实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明涵盖的范围。
权利要求
1.一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，包括以下步骤 1)选取小鼠尾静脉注射氯化钆溶液，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比为l(T20mg/25g，连续注射两日后进行手术,术前一天禁食； 2)消毒器械及动物工作台，36 38°C预温D-hanks液，1640培养液及胶原酶IV溶液； 3 )选取小鼠腹腔注射戊巴比妥钠及肝素钠，戊巴比妥钠的日注射量和小鼠体重之比为40 100mg/kg,肝素钠40 60U/只； 4)待小鼠完全麻醉后固定于动物手术台，消毒小鼠腹部，无菌纱布铺巾防止污染； 5)取正中切口进腹，撑开腹腔，将肠管拨向左下腹，暴露门静脉及下腔静脉； 6)连接五十毫升注射器、灌注泵、延长管及静脉留置针，开启灌注泵，让预温的D-hanks液充满延长管及静脉留置针，排净空气； 7)静脉留置针穿刺门静脉，成功后拔出针芯，双重丝线结扎，D-hanks液被泵入门静脉，观察到肝脏颜色变成土黄色时，剪开下腔静脉，调整灌流速度为30ml/h ； 8)依次剪开肝脏周围韧带及膈肌，将肝脏迅速完整的分离下来，勿损伤肝脏，将其置于预先放置了 36 38°C D-hanks液的培养皿中，持续D-hanks液灌注25 40min ； 9)然后，将灌流液体换为预温的胶原酶IV溶液，调整灌流速度为15 17ml/h，灌流2(T30min后，拔出静脉留置针，将肝脏置于胶原酶IV溶液中于37°C温箱放置l(T20min ； 10)从温箱中取出肝脏，将肝脏置于100目滤网上，减去胆囊及与肝脏相连的膈肌、韧带、肝门区血管，无损伤镊剥离肝包膜，挑去其中脉管系统，用预温的1640培养液反复冲洗将细胞滤过滤网； 11)过滤后的细胞悬液低速50g离心3min，使肝脏实质性细胞沉淀，取上清液以800g离心IOmin后，取细胞沉淀以3毫升1640培养液重悬，得细胞悬液备用； 12)在离心管中，分别铺3ml的50%percoll溶液，3ml的25%percoll溶液,及3ml细胞悬液，常温离心1200g, 20 40min ； 13)取两层percoll液体之间的细胞层，用1640培养液重悬混匀后，2000rmp离心lOmin，去掉上清，所得沉淀用1640培养液重悬并同样条件再离心一次，取沉淀得到待培养细胞，在体积百分比浓度为20%的胎牛血清中培养； 14)观察待培养细胞的贴壁状态，待细胞贴壁I小时后，取未贴壁细胞悬液于新容器中培养，12小时后换液，去除未贴壁细胞及死亡细胞，即为肝窦内皮细胞； 其中，所述胶原酶IV溶液的质量浓度为O. 05、. 1%。
2.根据权利要求I所述的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，其特征在于所述氯化钆溶液的浓度为90 120mg/ml。
3.根据权利要求I所述的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，其特征在于所述氯化钆溶液的浓度为100mg/ml。
4.根据权利要求2或3所述的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，其特征在于所述氯化钆溶液的配制方法为按照每Iml无内毒素0. IM磷酸盐缓冲液或每Iml生理盐水溶解9(Tl20mg氯化礼的比例配制,并过滤除菌。
5.根据权利要求I所述的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，其特征在于所述步骤I)中，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比为10mg/25g。
6.根据权利要求I所述的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，其特征在于所述25%percoll溶液和50%percoll溶液的配制方法为percoll原液高压消毒，然后,9份percoll原液混合I份质量浓度为8. 5%的生理盐水，混匀后为100%perCOll溶液；取I. 5ml的100%percoll溶液混合I. 5ml的生理盐水，配制为50%percoll溶液；取O. 75ml的100%percoll溶液混合2. 25ml的生理盐水，配制为25%percoll溶液。
7.根据权利要求I所述的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，其特征在于所述胶原酶IV溶液的质量浓度为O. 05%。
8.根据权利要求I或7所述的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，其特征在于所述质量浓度为O. 05、. 1%的胶原酶IV溶液的配制方法为每200ml的D-hanks液中溶解10(T200mg胶原酶IV，4°C搅拌过夜，过滤除菌后，分装保存。
全文摘要
本发明公开了一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，该方法利用氯化钆注射清除枯否细胞，结合两步灌流、差速离心、percoll离心、差速贴壁的来实现敢斗内皮细胞的分离。小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，简单易行、细胞纯度高、获得率高，并在体外培养保留完整的结构和功能活性，可用于生化及免疫学。此外，本发明方法使用实验室常规仪器，成本低可在大部分实验室推广。
文档编号C12N5/071GK102787096SQ20121026809
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者张进祥, 王国梁, 王慧 申请人:张进祥, 王国梁, 王慧