专利名称：一种col4a5基因突变的检测方法
技术领域：
本发明涉及基因突变检测技术领域，特别是涉及一种C0·L4A5基因突变的检测方法。
背景技术：
Alport综合征(Alport syndrome, AS),又称为遗传性肾炎、家族性肾炎、遗传性进行性肾炎，是一种主要表现为血尿、肾功能进行性减退、神经性耳聋和眼部异常的遗传性肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)疾病。临床上AS并非罕见，据文献报道AS在肾小球疾病中占2%，在终末期肾衰病人中约占5%，在肾移植病例中约占2. 3%，在成人肾活检中占O. 3%，而在儿童肾活检中占I. 7-2. 5%。同时AS具有临床异质性，临床表现多样，典型患者具有家族史，表现为血尿、蛋白尿、进行性肾功能不全伴眼耳病变，但相当一部分患者临床表现极不典型，可仅表现为镜下血尿和/或蛋白尿。我国AS患者在临床上具有蛋白尿表现较重，耳聋、眼部异常的发生率较高，尤其是青少年型较多等特点。因此，寻求筛查和诊断AS的有效手段一直是国内外科研工作者和临床医生努力的方向。随着对AS认识的逐渐深入以及电镜检查、IV型胶原α 5链的IFI和基因突变检测技术的进步，AS已由“眼、耳、肾疾患”这一临床综合症的诊断发展为包括临床、病理、遗传型以及突变基因的综合诊断，临床上对AS的确认率有了明显的提高。但相比较而言，临床上AS的总检出率仍较低，因此建立一种普遍适用的筛查手段极待解决。按照AS的遗传方式，可分为伴X染色体显性遗传、常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传3种，其中X连锁显性遗传占总AS人数的85%。伴X染色体显性遗传的AS病变基因位于X染色体长臂中部Xq21_q22，其基因突变为编码IV型胶原α 5链的C0L4A5。C0L4A5基因共有51个外显子，大小为140kb。自1990年Barker等报道第一个C0L4A5基因突变，至今已有400多种C0L4A5基因突变被发现，其中大多为小片段突变，包括错义突变、无义突变、剪接突变、单个碱基缺失或插入等。因此，对C0L4A5基因的分析研究对Alport综合征患者的诊断及其家系成员的遗传咨询意义重大。目前，国际上普遍采用的C0L4A5基因检测是从基因组DNA水平进行PCR扩增测序来检测突变，然而这种方法费时费力。2002年王芳等人创新开展了从患者皮肤成纤维细胞经体外培养提取mRNA，通过RT-PCR分5个片段扩增C0L4A5基因，其与基因组DNA分析C0L4A5基因相比不仅经济而且显著提高了 C0L4A5基因突变检出率(王芳，丁洁，俞礼霞，杨霁云，检测皮肤成纤维细胞cDNA确定Alport综合征C0L4A5基因突变，北京大学学报(医学版)；2002，34(3) :219-224.)。然而，皮肤成纤维细胞体外培养对环境和操作者要求严格，细胞培养耗时长达2 4个月，且培养费用高昂，从而增加了 C0L4A5基因检测的成本，因此研究探索新的方法检测C0L4A5基因突变非常必要
发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种耗时短、成本低、无需进行体外培养的C0L4A5基因突变的检测方法，本方法操作方便、简单易行，还有利于异地样本的转运。为了达到上述目的，本发明一方面提供一种C0L4A5基因突变的检测方法，包括如下步骤A)从脱离人体的皮肤组织中直接提取RNA ；B)对RNA进行RT-PCR，得到PCR扩增产物；C)对PCR扩增产物进行测序，将测序结果与正常人体C0L4A5基因序列进行比对，分析是否发生基因突变。
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其中，所述皮肤组织的表面积彡4mm2,优选为4_8mm2,进一步优选为4mm2。特别是，从所述脱离人体的皮肤组织中直接提取得到的RNA的量> 2 μ g。其中，所述步骤A)包括Al)将脱离人体的皮肤组织与液氮混合后进行研磨处理，得到研磨混合物；A2)向研磨混合物中加入Trizol试剂提取RNA，得到RNA提取液；A3)纯化RNA提取液，得到RNA。特别是，步骤Al)中所述皮肤组织与液氮混合后进行研磨处理的目的是使皮肤组织脆化，从而更有利于皮肤组织的破碎；所述研磨处理可以采用研钵或本发明的皮肤组织研磨装置进行。尤其是，步骤A3)中所述纯化处理包括首先采用氯仿去除RNA提取液中的蛋白类杂质；再采用异丙醇沉淀RNA ;最后采用75%的乙醇洗涤RNA沉淀。其中，在提取RNA前，将所述脱离人体的皮肤组织贮存于保存溶液中，其中所述保存溶液选自生理盐水，DMEM培养基或RNA store样品保存液，优选为RNA store样品保存液。特别是，所述皮肤组织贮存的温度为4_37°C ;所述皮肤组织贮存的时间< 7天，优选为彡3天。其中，所述步骤B)包括BI)以步骤A)中的RNA为模板，以random hexamers为引物,采用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链；B2)根据已报道C0L4A5基因mRNA设计5对引物，以上述cDNA第一链作为模板，分五个片断进行PCR扩增，得到五个PCR扩增产物。本发明再一方面提供一种用于破碎小量皮肤组织的皮肤组织研磨装置，包括底座；设置在所述底座内部的电机，其转轴从所述底座顶部垂直伸出；与所述转轴连接的下研磨装置；位于所述下研磨装置上方并且可以垂直移动的上研磨装置。其中，所述下研磨装置包括与所述转轴连接的研磨杯；以及安装在所述研磨杯底的下研磨部。特别是，所述上研磨装置包括
内部设有弹簧的套筒，所述弹簧一端与套筒顶部连接；与所述弹簧另一端连接的支杆，其从套筒底部垂直伸出；以及与所述支杆连接的上研磨部。尤其是，所述下研磨部和上研磨部为研磨片，其表面布有毛刺或凸起。其中，本发明的皮肤组织研磨装置还包括支架系统，其包括设置于所述底座上的竖直支架；以及与所述套筒连接的水平支架，其与所述竖直支架连接并且可以相对竖直支架垂直移动。
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特别是，所述竖直支架上垂直分布弹性凸起，其可伸出或陷入竖直支架中；所述水平支架的末端为套环，其可套入竖直支架中并通过弹性凸起相对竖直支架垂直移动或相对固定。其中，所述转轴与研磨杯的连接方式为可拆卸连接。特别是，所述可拆卸连接为插接或螺纹连接。其中，所述研磨杯、下研磨部以及上研磨部的材质为不锈钢。与现有技术相比，本发明具有以下优点I、本发明方法直接从皮肤组织提取RNA，经RT-PCR扩增C0L4A5基因后进行检测，由于无需对皮肤成纤维细胞进行体外培养，从取材到完成C0L4A5基因扩增仅需要2天，极大的缩短了 C0L4A5基因突变的检测时间，节省了细胞培养的费用，检测方法成本低廉；2、本发明方法直接从皮肤组织样本中提取RNA进行基因突变检测，更接近于蛋白水平，突变检出率大大提高；此外，本发明方法皮肤组织样本用量小，表面积达到4mm2即可用于检测，操作方便、简单易行；3、本发明的样本于常温下在保存液体中保存7天以内仍可用于检测，从而有利于异地样本的转运，方便了异地样本的检测；4、本发明的皮肤组织研磨装置采用具有毛刺或凸起的研磨片进行研磨，不仅增加了摩擦阻力，而且能够较好地使皮肤组织相对固定，研磨效果好，无需人工手动操作，省时省力；5、本发明的皮肤组织研磨装置通过研磨杯的旋转能够使研磨的样品产生离心力而处于研磨杯的下部，样品不易流失；此外可以通过弹簧的弹力来调节摩擦压力，适用于多种研磨需要。
图I是本发明皮肤组织研磨装置的结构示意图；图2是本发明皮肤组织研磨装置的工作状态示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例I一、材料I、皮肤组织样本来源于北京大学第一医院男科包皮环切术手术后废弃的患者的皮肤组织；2、DMEM培养基购自北京四环阳生生物工程科技有限公司；RNA store样品保存液购自北京天根生化科技有限公司；Trizol 试剂购自 Invitrogen ；M-MLV逆转录酶、random hexamers随机引物、Taq酶购自Promega公司；
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二、方法I、皮肤组织样本的保存及预处理将采集到的皮肤组织样本于室温下(25°C )贮存于RNA store样品保存液中6小时后，取出，用手术刀分IllJ成表面积为2X2_的皮肤组织块；2、从皮肤组织块直接提取RNA2. I 提取 RNA将上述皮肤组织块置于研钵后，向研钵中加入少量液氮进行研磨，待皮肤组织块磨碎后制得研磨混合物；向研磨混合物中加入ImL Trizol试剂，用移液枪反复吹打、混匀后转移到EP管中，在2-8°C下以12，OOOg的离心力高速冷冻离心10分钟，取上清，得到RNA提取液；2. 2 纯化 RNA向RNA提取液中加入200 μ L氯仿，摇晃混合均匀后于常温静置5min，再于2_8°C下以12，OOOg的离心力离心10分钟，去除蛋白等杂质；取离心后的上清液，加入500 μ L异丙醇，混合均匀后于2_8°C下以12，OOOg的离心力高速冷冻离心10分钟，沉淀RNA ；取离心后的沉淀，加入ImL 75%乙醇洗涤，旋涡振荡混合样品后于2_8°C下以7, 500 Xg的离心力高速冷冻离心5分钟，弃上清，待沉淀中的乙醇挥干后，加入14 μ I DEPC水溶解RNA，得到RNA溶液，RNA溶液的浓度为381. 13ng/ μ L，0D260/280比值为I. 69 ；3、RT-PCR 扩增 C0L4A5 基因3. I 合成第一链 cDNA按照M-MLV逆转录酶说明书进行第一链cDNA的合成，具体步骤如下将2 μ g 上述提取的 RNA, 200ng random hexamers 随机引物，I μ LlOOmMdNTP 混合物(dATP，dGTP，dCTP和dTTP均为10mM，pH中性)加入无核酸酶的微量离心管中，加入灭菌蒸馏水至12 μ L，得到混合物；将上述混合物于65°C下加热5min后，迅速置于冰上冷却，短暂离心后，加入4 μ L5Χ 第一链合成缓冲液[250mM Tris-HCl (ρΗ8· 3，室温)，375mM KCl, 15mM MgCl2]和 2yL
0.IM DTT，在离心管中轻轻将各成分混合均匀，于37°C下孵育2min后，在室温下加入I μ L(200单位)M-MLV逆转录酶，轻轻吹打混匀后于25°C孵育lOmin，再于37°C孵育50min ;最后于70°C下加热15min终止反应，使用I μ L (2单位)的E. coli RNase H在37°C孵育20min以去除与cDNA互补的RNA，即制得cDNA第一链；3. 2合成扩增cDNA片段的引物
根据已报道的C0L4A5基因mRNA序列，设计5对引物以扩增C0L4A5基因编码区mRNA,引物由 AuGCT Biotechnology Co. Ltd.和 Sangon Biotechnology Co. Ltd 合成,5 对引物的序列如表I所示；3. 3cDNA 片段的 PCR 扩增分别在25 μ L反应体系中加入上述合成的cDNA2 μ L，I. 5mM MgCl2, 200 μ MdNTPs,
0.2 μ M上、下游引物和I. 25U Taq酶；PCR反应条件为:首先95°C预变性5min，然后95°C变性30s，退火Imin (各退火温度见表I)，72。。延伸2min，循环35圈，最后72°C延伸7min,即扩增得到五个片段A-E，其大小分别为1098bp、1091bp、1191bp、1207bp、1017bp ；表IPCR扩增C0L4A5基因cDNA引物序列及反应条件·
片段I上游引物(5’-3’)下游引物(5’-3’)退火温度
~ TCTCTTCACCCAAGCCTCAC (69)CACCAGGGTAACCAGGATCA (1169)58Γ
~ ACCAGGCAAAGATGGAGAAA (1099)CCGGCTGGGTTATAGTCTGA (2189)55Γ
C AAGGTGTGGCAGG AAATCCA (2112)AAAACCCATATCACCGATGG (3304)55Γ
~ AAGGAACCATCGGTGATATG (3279)AGACCTGGGTCTCCTTTGC (4503)55Γ
~ GCCTGGGCTAAAGGGTCTAC (4369)CATTGACGGCAGCAGTAGTATA (5386)55Γ4、测序及比对将上述PCR产物送北京华大基因研究中心直接测序，将测序结果与正常人体C0LAA5基因序列进行比对，分析是否发生基因突变。实施例2除皮肤组织样本的保存及预处理步骤中，将采集到的皮肤组织样本于不同温度下贮存于不同保存液体中一段时间后，取出，用手术刀分割成不同表面积的皮肤组织块外，其它均与实施例I相同；皮肤组织样本的保存及预处理相关参数及制备的RNA溶液的浓度见表2。表2皮肤组织样本的保存及预处理相关参数及制备的RNA溶液的浓度
权利要求
1.一种C0L4A5基因突变的检测方法，包括如下步骤 A)从脱离人体的皮肤组织中直接提取RNA； B)对RNA进行RT-PCR，得到PCR扩增产物； C)对PCR扩增产物进行测序，将测序结果与正常人体C0L4A5基因序列进行比对，分析是否发生基因突变。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述皮肤组织的表面积>4mm2。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述皮肤组织的表面积为4mm2。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，从所述脱离人体的皮肤组织中直接提取得到的RNA的量>2 μ g。
5.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步骤A)包括 Al)将脱离人体的皮肤组织与液氮混合后进行研磨处理，得到研磨混合物； A2)向研磨混合物中加入Trizol试剂提取RNA，得到RNA提取液； A3)纯化RNA提取液，得到RNA。
6.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，在提取RNA前，将所述脱离人体的皮肤组织贮存于保存溶液中，其中所述保存溶液选自生理盐水，DMEM培养基或RNA store样品保存液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述皮肤组织贮存的温度为4-37°C。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述皮肤组织贮存的时间<7天。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，采用皮肤组织研磨装置进行所述的研磨处理，其中所述皮肤组织研磨装置包括 底座； 设置在所述底座内部的电机，其转轴从所述底座的顶部垂直伸出； 与所述转轴连接的下研磨装置； 位于所述下研磨装置上方并且可以垂直移动的上研磨装置。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述下研磨装置包括 与所述转轴连接的研磨杯；以及 安装在所述研磨杯底的下研磨部； 所述上研磨装置包括 内部设有弹簧的套筒，所述弹簧一端与套筒顶部连接； 与所述弹簧另一端连接的支杆，其从套筒底部垂直伸出；以及 与所述支杆连接的上研磨部。
全文摘要
本发明公开了一种COL4A5基因突变的检测方法，首先从脱离人体的皮肤组织中直接提取RNA；然后对RNA进行RT-PCR，得到PCR扩增产物；再对PCR扩增产物进行测序，将测序结果与正常人体COL4A5基因序列进行比对，分析是否发生基因突变。本发明无需进行体外细胞培养，因此耗时短、成本低、操作方便、简单易行；此外，本发明皮肤组织样本用量少，且样本于常温下在保存液体中保存0-7天后仍可用于检测，从而有利于异地样本的转运及检测。
文档编号C12Q1/68GK102787167SQ20121029049
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者丁洁, 张宏文, 张琰琴, 王芳 申请人:北京大学第一医院