专利名称：虹鳟肠炎红嘴病的pcr检测方法及检测用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及肠炎红嘴病的PCR检测方法及检测用引物。
背景技术：
虹鳟肠炎红嘴病(Enteric redmouth disease,ERM)又称为肠性红嘴病、鲑鳟鱼血点病，由鲁氏耶尔森氏菌感染引起，主要经ロ传染。由于皮下出血导致嘴及咽喉发红，外部症状表现为下颌发红或溃烂，体色变黑，鳍基充血，两侧眼球外突，活动迟缓，食欲下降或绝食，肌肉、体内脂肪及消化道出血，有时消化道积黄色液体，肾脏及脾脏微肿。该病主要在虹鳟养殖区流行，危害体长为7. 5厘米以下的鱼体，对虹鳟养殖产业造成了严重经济损失。该病易与虹鳟弧菌病、疥疮病混淆。目前对该病的检测主要是根据其临床症状来推測，准确率相对较低，容易导致误诊。对病原菌则主要是采用传统的生理生化鉴定方法， 耗时耗カ且准确率不高，因此有必要研究ー种针对该病原的快速、灵敏、可操作性强的检测方法，以便用于ERM的早期诊断。
发明内容
本发明是要解决现有的虹鳟肠炎红嘴病的检测存在耗时耗カ且准确率不高的问题，而提供虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法及检测用引物。虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测用引物的上游引物YR-F的核苷酸序列为TGGAGGGGGATAACTACT,下游引物 YR-R 的核苷酸序列ACAITTCACAACACGAGC。虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法，按以下步骤进行一、提取虹鳟肠炎红嘴病的病原鲁氏耶尔森氏菌的总DNA作为模板，根据Genbank数据库中Y.ruckeri 16S rRNA基因序列(登录号AB681666. 1)，利用Primer Primier 5设计ー对特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；ニ、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在946bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在946bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成虹鳟肠炎红嘴病的PCR检測；其中步骤一中特异性引物的上游引物YR-F的核苷酸序列5’-TGGAGGGGGATAACTACT-3’ ；下游引物 YR-R 的核苷酸序列5 ’-ACAITTCACAACACGAGC-3 ’。本发明设计的特异性引物YR-F/YR-R可有效扩增鲁氏菌16S rRNA基因片段，其检测精度达到IOpg的模板DNA，且检测成本相对较低。本发明虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法操作简单，可迅速诊断虹鳟红嘴病，准确度高、灵敏且低浓度下敏感性很好。本发明虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法从样品采集、细菌培养到菌落PCR鉴定所需时间不超过24h，结合病鱼临床病症，可迅速准确的诊断虹鳟鱼肠炎红嘴病。
图I为实施例中鲁氏耶尔森氏菌16S rRNA基因PCR扩增结果的电泳图，其中M :DL2000marker,泳道I :以鲁氏菌基因组DNA为模板，泳道2 :阴性对照；图2为对照实验中PCR特异性试验结果的电泳图，其中M DL2000marker,泳道I 泳道4:分别以鲁氏耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟缓爱德华氏菌基因组DNA为模板进行PCR扩增；图3为PCR敏感性试验结果的电泳图，其中M DL2000marker,泳道I 泳道6，模板浓度依次为100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg,泳道7 :阴性对照。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测用引物的上游引物YR-F的核苷酸序列为TGGAGGGGGATAACTACT，下游引物YR-R的核苷酸序列 ACATTTCACAACACGAGC。
具体实施方式
ニ 采用具体实施方式
一中所述引物进行虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法，按以下步骤进行一、提取虹鳟肠炎红嘴病的病原鲁氏耶尔森氏菌的总DNA作为模板，根据Genbank数据库中Y. ruckeri 16S rRNA基因序列(登录号AB681666. I),利用Primer Primier 5设计ー对特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；ニ、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在946bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在946bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测；其中步骤一中特异性引物的上游引物YR-F的核苷酸序列5’ -TGGAGGGGGATAACTACT-3’ ；下游引物 YR-R 的核苷酸序列5’ -ACAITTCACAACACGAGC-3’。本实施方式中确定结果为阳性即虹鳟患有肠炎红嘴病；确定结果为阴性即虹鳟患有的不是肠炎红嘴病。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同是步骤一中PCR扩增的反应体系为25 ii L反应体系，由下列成分组成
成分用量
模板I |iL
IOpM 引物 YR-FI^iL
IOjiM 引物 YR-RI^iL
IOx PCRbuffer2.5|iL
IOmM 的 dNTP0.5|iL
25mM 的 MgCl2l.5|iL
5U/[iL Taq DNApolymerase0.2|iL
ddH2017.3|iLPCR扩增条件为95°C预变性5!^11，94で变性308，55で退火308，72で延伸60s，共30个循环，再72°C延伸10min，4°C结束反应。其它步骤及參数与具体实施方式
一相同。本实施方式中鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri) ATCC 29473,它为购买得到。本实施方式中Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR试剂购自宝生物工程有限公司；细菌基因组DNA试剂盒购自天根生化科技有限公司(试剂盒货号DP302-02) ;PCR仪为美国Biorad公司的SlOOO型号。实施例虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法，按以下步骤进行一、提取虹鳟肠炎红嘴病的病原鲁氏耶尔森氏菌的总DNA作为模板，根据Genbank数据库中Y.ruckeri 16S rRNA基因序列(登录号AB681666. 1)，利用Primer Primier 5设计ー对特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；ニ、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在946bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在946bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成虹鳟肠炎红嘴病的PCR检測；
其中步骤一中特异性引物的上游引物YR-F的核苷酸序列5’-TGGAGGGGGATAACTACT-3’ ；下游引物 YR-R 的核苷酸序列5 ’-ACAITTCACAACACGAGC-3 ’。本实施例中确定结果为阳性即虹鳟患有肠炎红嘴病；确定结果为阴性即虹鳟患有的不是肠炎红嘴病。本实施例中PCR扩增的反应体系为25 ii L反应体系，由下列成分组成
成分用量
模板I pL
IOpM 引物 YR-FI^L
IO1IM 引物 YR-RI^L
IOx PCRbuffer2.5|iL
IOmM 的 dNTP0.5|iL
25mM 的 MgCl21.5|iL
5l.J/[iL Taq DNA polymerase0.2|iL
ddH20] 7.3 |iLPCR扩增条件为95°C预变性5!^11，94で变性308，55で退火308，72で延伸60s，共30个循环，再72°C延伸10min，4°C结束反应。本实施例中鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri) ATCC 29473,它为购买得到。结果在预期的946bp处有目的片段扩增(如图I)。对照实验分别以鲁氏耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟缓爱德华氏菌的基因组DNA为模板，利用YR-F/YR-R引物进行PCR扩增。本实施例中嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) ATCC7966,它为购买得到；温和气单胞菌(Aeromonas sobria)ATCC9071 ;它为购买得到；迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda) ATCC 23685，它为购买得到。
对照实验结果仅鲁氏耶尔森氏菌能在预期的946bp处有目的片段扩増，而其他三株细菌均未扩增出任何DNA条带(如图2)。PCR敏感性试验结果将鲁氏耶尔森氏菌基因组DNA模板分别稀释至IOOng/ii L、IOng/ii L、lng/ii L、IOOpg/ u L，IOpg/ ii L和lpg/ u L的浓度，并分别取I u L作模板进行PCR扩增。结果表明，本方法可检测到IOpg的鲁氏菌基因组DNA模板(如图3)，可见本方法在低浓度下敏感性很好。菌落PCR试验结果鉴于以基因组DNA为模板需要先挑取单菌落置于TSB液体培养基中振摇过夜，并用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，步骤相对繁琐，因此选用菌落PCR作为定性检测鲁氏耶尔森氏菌的方法。 将鲁氏耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌分别划线培养，用灭菌牙签从单菌落上挑取少量菌体作为模板，利用YR-F/YR-R引物进行PCR扩增，并与常规PCR结果进行比较。结果表明，菌落PCR和常规PCR方法均能有效扩增鲁氏菌16SrRNA基因的目的条带，而其他菌株检测结果为阴性。
权利要求
1.虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测用引物，其特征在于虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测用引物的上游引物YR-F的核苷酸序列为TGGAGGGGGATAACTACT，下游引物YR-R的核苷酸序列ACATTTCACAACACGAGC。
2.如权利要求I所述虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测用引物进行虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法，其特征在于虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法，按以下步骤进行一、提取虹鳟肠炎红嘴病的病原鲁氏耶尔森氏菌的总DNA作为模板，根据Genbank数据库中Y. ruckeril6SrRNA基因序列(登录号AB681666. I),利用Primer Primier 5设ii^一对特异性引物,进行PCR扩增，获得扩增产物；二、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在946bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在946bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测； 其中步骤一中特异性引物的上游引物YR-F的核苷酸序列5’ -TGGAGGGGGATAACTACT-3’ ；下游引物 YR-R 的核苷酸序列5’ -ACAITTCACAACACGAGC-3’。
3.根据权利要求2所述的虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为25 μ L反应体系，由下列成分组成 成分用量 模板I pL ΙΟμΜ 引物 YR-F ΙΟμΜ 引物 YR-R IOx PCRbuffer2.5μ IOinM 的 dNTP0.5μ 25mM 的 MgCl2Ι.5μ 5U/pL Taq DNA polymerase0.2μ ddH2017 μ L PCR扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，Il C延伸60s，共30个循环，再72°C延伸10min，4°C结束反应。
全文摘要
虹鳟肠炎红嘴病的PCR检测方法及检测用引物，涉及肠炎红嘴病的PCR检测方法及检测用引物。它为了解决现有的虹鳟肠炎红嘴病的检测存在耗时耗力且准确率不高问题。检测用引物上游引物YR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物YR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。方法一、提取虹鳟肠炎红嘴病的病原鲁氏耶尔森氏菌的总DNA作为模板，设计引物，PCR扩增；二、扩增产物观察，鉴定后即完成。本发明设计的特异性引物检测精度达到10pg的模板DNA，且检测成本相对较低；检测方法操作简单，可迅速诊断虹鳟红嘴病，准确度高、灵敏且低浓度下敏感性很好，鉴定所需时间不超过24h。
文档编号C12R1/01GK102766698SQ20121029586
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月20日 优先权日2012年8月20日
发明者卢彤岩, 李绍戊 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所