专利名称：一种植生拉乌尔菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵领域，具体地涉及一种植生拉乌尔菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。
背景技术：
香兰素(Vanillin)，又名香草醛、香兰醛等，是香荚兰豆中的主要成分，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，相对分子量为152. 15。香兰素外观为白色至微黄色针状结晶或粉末，呈香荚兰豆特有的香气，微甜，在潮湿的空气中缓慢氧化为香兰酸。香兰素是世界上产量最大、用途最广的香料之一，被誉为“香料之王”，广泛应用于巧克力、冰淇淋、糖果等食品以及香烟、饮料和高档化妆品中。它不仅可以用作增香剂和定·香剂，还在食品中用作防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂。香兰素的世界年消费量约I. 2万吨，而天然香兰素的产量仅为1800吨，因此远不能满足需求。目前常用的香兰素生产方法有植物原料提取法和化学合成法。香兰素在香荚兰豆中含量约为15 20g/kg。香荚兰种植受地域和气候环境的限制产量极少，且在种植过程中需要对花朵进行人工授粉、劳动强度大，难以进行大规模栽种，远远不能满足市场的需求。目前市场上绝大多数的香兰素产品是通过化学合成的，常用合成底物包括丁香酚、木质素、乙醛酸和愈创木酚等。国内常用的是采用愈创木酚和乌洛托品反应的亚硝化工艺，该方法路长，分离过程复杂，收率低，环境污染严重，原料消耗高，国外早已被淘汰。国外主要采用愈创木酚和乙醛酸缩合工艺，该工艺设备简单，产物纯度高，原料来源广泛，但是存在严重的缺陷，比如环境污染严重，产品香气单一，易掺杂质，合成香兰素的安全性也受到质疑。生物转化法是在细胞或酶等生物催化下进行的化学反应，既是指利用微生物(微生物的生长细胞、微生物的休止细胞)、酶(来自微生物或动植物的纯酶或粗酶)或植物细胞，通过简单的生物转化或生物合成制备所需物质的方法。与化学催化剂相比，生物催化剂专一性更强、催化活性更高、条件更易控制。可接受大量的外源复杂分子作为底物，化学选择性、区域选择性、立体选择性或对映选择性的催化底物生成相应的产物。用生物转化法生产的香兰素与植物提取的天然香兰素等同(Natural-identical vanillin),被称为生物香兰素(Bilogic Vanillin)。许多天然物质如阿魏酸、1，2-二苯乙烯酚、丁香酚、木质素、异丁香酚等都可以作为生物转化生产香兰素的前体物质。利用微生物发酵的方法，模拟酶在香荚兰中讲解阿魏酸衍生物时产生香兰素的过程而得的“natural vanillin”，符合EU和FDA对天然香精的使用安全要求。关于用多种微生物发酵法将阿魏酸转化为香兰素已有报道，培养基成分较为复杂,生产成本较高,副产物较多包括香兰酸、香兰醇和愈创木酚等,给产品分离提取带来了相当的困难。经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一株植生拉乌尔菌及用此植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸来生产天然香兰素的方法。本发明提供一种植生拉乌尔菌,该菌株名为Raoultella planticola VP4-4,于2012年I月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2012005，植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005的生物学特征是革兰氏阴性菌，能产酸、使牛奶液化并生成吲哚产生、赖氨酸脱羧酶实验呈阳性；鸟氨酸脱羧酶实验、H2S产生、明胶液化呈阴性；能以单糖，多糖、酯类和氨基酸为唯一碳源生长，所述植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4的分子鉴定特征为其16SrRNA 序列全长 1408bp, 16S rRNA 序列与 Raoultella planticola 的相似度达到99.563%。本发明提供一种利用植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其步 骤如下I)菌种活化取植生拉乌尔菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接种到斜面培养基上，在25 38°C条件下，静置培养24 72h后得到活化菌种；2)制备种子培养液将步骤I)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25 38°C条件下，100^150rpm/min振荡培养24tT72h，连续转接f 3次，制得种子培养液；3)发酵将步骤2)中所得的种子培养液，按体积百分比2 20%的接种量接入发酵培养基，在32 40°C条件下，100"200rpm/min振荡培养24 72h ；4)转化向步骤3)中所得的发酵液，加入2^10g/L的阿魏酸，在3(T40°C条件下，lOO^OOrpm/min振荡避光培养7天后停止；5)将步骤4)中所得发酵液，在8000 10000rpm/min条件下，12 15min离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液；所得到的天然香兰素发酵液浓度可达
I.2 2. lg/L，转化率为 15. 12 27. 15%。优选地，所述步骤I)中，斜面培养基麦芽汁120mL，蔗糖20g/L，琼脂15g/L。优选地，所述步骤2)中种子培养基麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。优选地，所述步骤3)中，所述发酵培养基碳源5 20g/L，氮源f3g/L，KNO3 I 3g/L，NaCl :0. 5 I. 5g/L, K2HPO4 :0. 5 I. 5g/L, MgSO4*7H20 :0. 5 I. 5g/L, FeSO4*7H20 O. ΟΓΟ. 05g/L，调节 pH :3 10。优选地，所述碳源为淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮和谷壳之中一种或多种。碳源最优选为麦芽浸粉。优选地，所述氮源为豆柏、黄豆饼粉、牛肉膏、蛋白胨(Arg)、酵母粉、大豆蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵和磷酸铵之中的一种或多种。氮源最优选为蛋白胨(Arg)。本发明研究的理论依据I.不同碳源、氮源和无机盐对香兰素产量的影响以高氏一号培养基为基础培养基，对其中的碳源、氮源和无机盐进行单因素实验，筛选出产香兰素最大的碳源、氮源和无机盐。I. I不同碳源对天然香兰素产量的影响以高氏一号培养基为基础培养基，固定氮源和无机盐，分别以淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮和谷壳作为碳源，浓度均为20g/L。由图I可知，不同碳源对香兰素产量影响由高到低依次是麦芽浸粉、空白(淀粉)、谷壳、蔗糖、麸皮、麦芽糖、葡萄糖和果糖。果糖明显不利于香兰素的产生，缓效碳源比速效碳源更易于香兰素的产生，缓效碳源中的复合碳源麦芽浸粉和谷壳可能由于其中含有生长因子而比单一碳源更易于香兰素的产生。其中以麦芽浸粉为碳源时产生的香兰素含量最高。I. 2不同氮源发酵生产天然香兰素的产量以高氏一号培养基为基础培养基，固定碳源和无机盐，分别以酵母粉、黄豆饼粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、动物蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵和豆柏作为氮源，浓度均为lg/L。由图2可知，不同氮源对香兰素产量的影响有高到低依次是蛋白胨(Arg)、空白、牛肉膏、酵母粉、磷酸铵、蛋白胨(Pep )、硝酸铵、硫酸铵、豆柏、黄豆饼粉。有机氮源中黄豆饼粉不利于香兰素的产生。以蛋白胨(Arg)作为氮源时比空白产生的香兰素更多。I. 3不同无机盐离子发酵生产天然香兰素的产量以高氏一号培养基为基础，固定碳源和氮源，分别以磷酸氢二钠、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钙作为无机盐，浓度均为O. 5g/L。由图3可知，以钠离子、钾离子、钙离子作为无机盐离子时香兰素的产量均很低，而以铁离子为无机盐时香兰素的产量高于其它无机盐。I. 4最佳碳源氮源和无机盐相对含量的确定-正交试验根据单因素实验结果分析，最佳碳源麦芽浸粉；最佳氮源大豆蛋白胨；最佳无机盐硫酸亚铁。选择麦芽浸粉、大豆蛋白胨和硫酸亚铁对香兰素产量影响较大的因素进行正交试验，确定它们的最佳配比，采用L9 (34)正交表，水平和因素安排见表I、表2。根据表2中极差R值可判断谷壳对香兰素产生是主要影响因素，三个因素对香兰素产量的影响顺序硫酸亚铁>麦芽浸粉>大豆蛋白胨，根据结果可知最佳组合为A2B3Cp表I正交设计因素表
权利要求
1.ー种植生拉乌尔菌，该菌株名为Raoultella planticola VP4-4，保藏号为CCTCCM 2012005，植生拉乌尔菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005 的生物学特征是革兰氏阴性菌，能产酸、使牛奶液化并生成吲哚产生、赖氨酸脱羧酶实验呈阳性；鸟氨酸脱羧酶实验、H2S产生、明胶液化呈阴性；能以单糖，多糖、酷类和氨基酸为唯一碳源生长,其16SrRNA序列全长1408bp,其16S rRNA序列与Raoultella planticola的相似度达到 99. 563%。
2.ー种植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法 ，其步骤如下 1)菌种活化取植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005 接种到斜面培养基上，在25 38°C条件下，静置培养24 72h后得到活化菌种； 2)制备种子培养液将步骤I)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25 38°C条件下，100^150rpm/min振荡培养24tT72h，连续转接f 3次，制得种子培养液； 3)发酵将步骤2)中所得的种子培养液，按体积百分比2 20%的接种量接入发酵培养基，在32 40°C条件下，100"200rpm/min振荡培养24 72h ； 4)转化向步骤3)中所得的发酵液，加入2 10g/L的阿魏酸，在3(T40°C条件下，lOO^OOrpm/min振荡避光培养7天后停止； 5)将步骤4)中所得发酵液，在800(Tl20000rpm/min条件下，12 15min离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液；所得到的天然香兰素发酵液浓度可达I. 2^2. Ig/L，转化率为15. 12 27. 15%。
3.根据权利要求2所述的ー种植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其特征在于所述步骤I)中，斜面培养基麦芽汁120mL，蔗糖20g/L，琼脂15g/L。
4.根据权利要求2所述的ー种植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其特征在于所述步骤2)中，种子培养基麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
5.根据权利要求2所述的ー种植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其特征在于所述步骤3)中，发酵培养基碳源5 20g/L，氮源l 3g/L，KNO3 :l 3g/L，NaCl 0. 5 I. 5g/L, K2HPO4 :0. 5 I. 5g/L, MgSO4·7Η20 :0. 5 I. 5g/L, FeSO4*7H20 :0. θΓθ. 05g/L，调节pH3 10。
6.根据权利要求5所述的ー种植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其特征在于所述碳源为淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮和谷壳之中ー种或多种。
7.根据权利要求6所述的ー种植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其特征在于所述碳源为麦芽浸粉。
8.根据权利要求5所述的ー种植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其特征在于所述氮源为豆柏、黄豆饼粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵和磷酸铵之中的ー种或多种。
9.根据权利要求8所述的ー种植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其特征在于所述氮源为蛋白胨。
全文摘要
本发明公开了一种植生拉乌尔菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。该植生拉乌尔菌菌株名为Raoultella planticola VP4-4，保藏号为CCTCC M 2012005，其16SrRNA序列全长1408bp，其16S rRNA序列与Raoultella planticola的相似度达到99.563%。该方法是利用该菌株，通过菌种活化、制备种子培养液、发酵培养、转化发酵液，以得到高浓度香兰素发酵液。本发明的优选方案，碳源、氮源成本很低，来源广泛易得，其发酵液中天然香兰素浓度大、产量较高。生产工艺过程简单，条件温和，环境友好，有工业化前景，具备良好的社会效益和经济效益。
文档编号C12P7/24GK102851240SQ20121032440
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者魏敏, 陈义坤, 罗诚浩, 宋旭艳, 李冉 申请人:湖北中烟工业有限责任公司