用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法。该方法以甜查理、达赛莱克特为杂交亲本进行常规杂交获得的杂交后代等250份材料的基因组DNA为模板，通过对覆盖全基因组146对SSR引物和64对AFLP引物进行PCR扩增并结合PAGE胶电泳分析，建立了草莓炭疽病抗性的特异遗传图谱，成功获得10对特异性高、在杂交后代显性强的SSR引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1~20所示。应用本发明方法获得的引物序列进行草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定，其鉴定结果与田间抗病吻合率高达88.4%，该方法具有简单、快速、高效，提高育种效率，缩短育种周期等优点，在草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定上具有很大的应用价值。
【专利说明】用于鉴定草莓种质资源炭疸病抗性的引物序列及其鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一类用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法。
【背景技术】
[0002]由炭疽病病菌(Colletotrichumn spp.)引起的草莓炭疽病是一种世界毁灭性病害，截至目前仍有许多国家的草莓生产上存在着该病的大面积危害。炭疽病可以危害草莓的茎、叶柄、叶片、果实、花、花芽、萼片等器官，不仅可造成严重的经济产量的损失，而且有的病残体含有较多的真菌毒素，严重地威胁着人们的食品安全。
[0003]草莓炭疽病于1832年在法国首次发现，距今已180年。有关草莓炭疽病病菌抗性鉴定的研究已经有一些报道。种质资源的抗逆性鉴定对于水果科研育种和生产都非常重要，单一根据田间表型性状来区分种质资源的抗逆性在多数情况下都很困难。DNA分子标记提供了物种根本的遗传特征，是不同物种遗传变异的直接反映，因此成为种质资源鉴定最有效途径。目前，有5种常见分子标记技术应用于品种抗逆性鉴定，包括RAPD、RFLP、AFLP、SSR、SCAR 标记。
[0004]建立在PCR基础上的分子鉴定技术是鉴定草莓炭疽病快速和准确的方法。Xiao等(2004)通过提取病原菌的 DNA并利用病菌ITS的RAPD分子标记进行病原菌遗传分析，以感病的草莓和非栽培寄主为材料鉴定了 C.gloeosporioides和C.acutatum的遗传关系。Denoyes-Rothan等(2005)设计了 8X8因子试验研究草莓炭疽病C.acutatum种的遗传特性，认为尽管微效多基因会影响草莓的抗性水平，但高水平抗性仍然被认为单基因控制，属于质量性状遗传。作者分析了 26个不同品种(基因型)，结果发现栽培草莓的炭疽病抗性遗传为显性基因，草莓属其它种 类的遗传特性相似，对草莓炭疽病抗性育种有指导意义。
[0005]随着红颜、章姬、丰香等品质好易感病草莓品种栽培面积的不断扩大，炭疽病侵害范围也在蔓延，如今已经成为草莓生产的第一大病害。因此创制与红颜果实品质媲美的抗病草莓新种质已成为迫在眉睫的问题。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法。
[0007]自1990年以来，上海农科院草莓课题组一直进行着草莓种质资源收集、评价与种质创制工作，并取得了 440余份具有潜在应用价值的种质。抗病性品种大都是通过传统杂交育种获得，对炭疽病病原菌免疫的种质在杂交后代中不会轻易产生；更重要的是抗病杂交后代携带有其它不良性状基因，特别是多基因控制的抗病性的遗传，常常造成育种效率较低。抗病性鉴定是抗病育种的重要环节，建立准确可靠的抗病性鉴定方法是提高抗病育种效率的重要途径。有关草莓炭疽病抗性鉴定方法迄今已经有许多报道，大都是将炭疽病病菌接种在发育植株上，然后依据一定的分级标准统计感病情况进行鉴定。在培育抗病品种时，要正确判断杂交亲本的抗病性，必须有正确的抗性评价鉴定方法。因此，基于上海农科院草莓课题组特异抗性种质的特异分子标记对高抗和高感亲本及其杂交后代群体的抗病性分子鉴定，对于育种科学家和草莓的生产管理均具有重要应用价值。
[0008]本发明在对覆盖栽培草莓全基因组210对标记引物(146对SSR引物和64对AFLP引物)筛选的基础上获得65份材料中可产生特异、稳定多态性、带型组合易识别、在其后代显性好的10对SSR引物，应用这10对引物以宝交早生、甜查理、达赛莱克特等为杂交亲本及其常规杂交获得的245份随机后代群体为材料，成功鉴定出炭疽病抗性后代。
[0009]本发明利用与抗性基因连锁的分子标记进行基因型验证，使受鉴定材料成为可以用于草莓炭疽病抗性育种的种质材料。为了进行宝交早生、甜查理、达赛莱克特及其杂交后代群体材料中炭疽病抗性的快速鉴定评价，本发明致力于全基因组范围筛选特异SSR标记指纹和AFLP分子标记，成功获得了能够鉴别亲本及其杂交后代群体的高度特异、稳定遗传的SSR、AFLP分子标记图谱。依据这些图谱，仅需应用散布于全基因组的10对特异SSR引物，针对样品DNA进行PCR扩增，后经PAGE电泳分析，即可快速鉴别是否亲本及其杂交后代品系的炭疽病抗性。利用获得的这10对特异SSR引物对亲本及其杂交群体共245份随机材料进行草莓炭疽病抗性的分子鉴定，结合田间抗感遗传表型的一致性，结果发现获得的这10对特异SSR引物可将供试材料中抗病品种或优系与感病品种或优系区分开来，与室内接种鉴定、田间遗传表型的一致性可达到88.4%。
[0010]本发明所述的草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定方法的工艺流程如图1所示，具体包括以下步骤:
[0011]I)首先，从草莓基因组数据库网站 GDR(Genome Database for Rosaceae, http://WWW.rosaceae.0rg/)与全基因组范围、遵循平均分布原则设计分子标记引物,共设计并合成了 210对标记引物,包括64个AFLP标记，146个SSR标记,具体参看表1。
[0012]表1草莓炭疽病抗性筛选SSR和AFLP分子标记引物及序列
`[0013]
【权利要求】
1.用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列，由上游引物和下游引物组成，其特征在于，上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1、2所示，或如SEQ ID N0.3、4所示，或如SEQ ID N0.5、6所示，或如SEQ ID N0.7、8所示，或如SEQ ID N0.9、10所示，或如SEQID N0.11、12 所示，或如 SEQID N0.13、14 所示，或如 SEQ ID N0.15、16 所示，或如 SEQ IDN0.17、18 所示，或如 SEQ ID N0.19,20 所示。
2.—种草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)草莓全基因 组SSR/AFLP引物的设计与合成以及草莓基因组DNA提取； 2)确定SSR/AFLP引物的最优PCR条件、电泳展示差异时间及染色显色方法并进行预筛选; 3)针对预筛选获得的14对SSR标记引物进行PCR扩增并结合PAGE电泳分析进行全面筛选； 4)对预筛选获得的14对SSR标记引物进行PCR扩增电泳分析进行重复筛选以验证遗传稳定性； 5)将全面筛选获得的10对SSR标记引物分别进行草莓炭疽病抗性的鉴定。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的14对SSR标记引物分别由上游引物和下游引物组成，上下游引物的核苷酸序列分别如⑴SEQID N0.1、2K*，(2)SEQ IDN0.3、4所示，(3)SEQ ID N0.5、6所示，(4)SEQID N0.7、8所示，(5)SEQ ID N0.9、10所示，(6)SEQID N0.11、12 所示，(7) SEQID N0.13、14 所示，(8) SEQ ID N0.15、16 所示，(9) SEQ ID N0.17、18 所示，(10) SEQ ID N0.19、20 所示，(11) SEQ ID N0.21、22 所示，(12) SEQ ID N0.23、24 所示，(13)SEQ ID N0.25、26 所示，(14) SEQ ID N0.27、28 所示。
【文档编号】C12Q1/68GK103667427SQ201210330786
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2012年9月7日
【发明者】高清华, 叶正文, 段可, 郑宏清, 李静, 刘建成, 傅弘平 申请人:上海市农业科学院