专利名称：一种肠上皮间淋巴细胞的分离方法
技术领域：
本发明属于细胞分离技术，涉及一种肠道中的肠上皮细胞间淋巴细胞的分离方法。
背景技术：
肠道是机体最大、最复杂的粘膜免疫器官，是识别“自我”和“异我”的重要器官，也是病原体入侵机体的主要门户，因此肠道粘膜免疫系统构成了机体抵抗病原体入侵的第
一道免疫屏障。肠道粘膜免疫系统包括集合粘膜相关淋巴组织(肠系膜淋巴结、Peyer’ s结)和 弥散粘膜相关淋巴组织(包括固有层淋巴细胞和肠上皮间淋巴细胞)。肠上皮间淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes, iIELs)是分散在肠道上皮细胞基底面之间的一种T淋巴细胞，即细胞表面标记为⑶3+，并且85%以上为⑶8+T淋巴细胞，而且含有15%以上的T细胞受体⑶8+TCRY δ+，是肠道粘膜免疫反应中的效应细胞，可分泌细胞因子，具有淋巴毒T淋巴细胞的作用，同时可抑制粘膜部位的过敏反应。因此，iIELs在不同生理病理状态下发挥着不同的免疫调节功能，在肠道粘膜免疫反应中具有非常重要的作用。目前分离iIELs多数采用机械法或酶消化法，不仅花费大量的时间，分离细胞非常复杂，存活率低，而且降低了分离后的iIELs的细胞活性，不利于针对性的研究iIELs的免疫调节功能。如何有效地分离肠道中的iIELs是急需解决的一个技术问题，为进一步深入研究iIELs在肠道粘膜免疫中的调节作用提供一个有力的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种存活率高的分离肠上皮间淋巴细胞的方法，能有效地分离肠道中的上皮间淋巴细胞iIELs。本发明所述的目的是通过以下措施实现的—种淋巴细胞分离方法，其特征在于所述分离方法是利用温差法与淋巴细胞分离液相结合的方法。上述淋巴细胞是肠上皮间淋巴细胞。上述温差法是指待分离细胞在0_5°C冰浴后，在0_5min内转移到30_40°C培养基中。优选为4°C冰浴，瞬间转移到37°C培养基中。瞬间转移是指在O-IOs内转移。上述冰浴的时间为1-4小时。优选为2小时。上述培养基是含有ImM 二硫代苏糖醇和10%小牛血清的DMEM培养基。上述淋巴细胞来源于大鼠小肠组织。上述淋巴细胞分离方法，其特征在于由以下步骤组成(I)小肠组织的提取和处理将禁食过夜的健康大鼠处死后，提取小肠组织，并用PBS冲洗肠腔，剪去peyer’ s结后，置于含有10 %小牛血清、I %青链霉素双抗的PBS中冰浴。(2) iIELs的分离利用30-40C预热的含有ImM 二硫代苏糖醇和10%小牛血清的DMEM培养基反复冲洗小肠组织肠腔，顺着肠道轻轻挤出肠腔中内容物。静置后离心，利用大鼠淋巴细胞分离液分离iIELs。(3)所获得的iIELs的鉴定通过胎盘蓝染色检测iIELs的活性，利用抗大鼠的APC-⑶3、FITC-⑶8和PE-TCR γ δ荧光抗体进行染色，通过流式细胞仪进行鉴定。上述淋巴细胞分离方法，其特征在于由以下步骤组成第一步，实验动物的选择选择无特殊病原体感染(SPF级)的健康大鼠(6 8周，雌雄不限)，禁食过夜；第二步，小肠组织的提取及处理 利用CO2处死大鼠后，迅速剖腹，从胃的幽门下段Icm处剪断小肠，直至盲肠上段Icm处取出小肠全部组织于PBS中；利用PBS反复清洗肠道，以去除肠道内的内容物及粘液；从小肠浆膜面剪去整个肠段中的每个peyer’s结,并将已剪掉peyer’s结的小肠段置于含有10%小牛血清和1%青链霉素双抗的PBS中，冰浴；第三步，肠上皮间淋巴细胞(iIELs)的分离利用37°C预热的含有ImM二硫代苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)和10%小牛血清的DMEM(Deulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基反复冲洗小肠肠腔后,用弯镊子顺着肠道轻轻将肠腔中的粘液及部分细胞挤出；收集上述DMEM液体于离心管中，静置15分钟后，轻轻吸取上清于另一离心管中，离心；加入小牛血清重悬细胞，使细胞悬液滤过100目的筛网后，将含有细胞的小牛血清缓慢加入到装有大鼠淋巴细胞分离液的离心管中，使淋巴细胞分离液与小牛血清细胞悬液中间保持明显的分层，离心；小心吸取分层界面中的白色絮状淋巴细胞，利用PBS洗去多余的淋巴细胞分离液；第四步，iIELs的鉴定利用胎盘蓝对分离获得的淋巴细胞进行染色，显微镜下观察计数细胞活性；同时使用APC标记的⑶3、FITC标记的⑶8和PE标记的TCR γ δ抗大鼠抗体对分离的淋巴细胞进行染色，流式细胞仪进行检测检测鉴定。本发明有益效果(I)本发明分离的淋巴细胞，存活率高，能达到90%以上。在⑶3+标记的T淋巴细胞中，⑶8+Τ淋巴细胞比例达到85-95%，而有30%是⑶8+TCR γ δ +双阳性T淋巴细胞，检测结果完全符合iIELs的表性特征。(2)本发明所构建的分离方法简单易行，耗时少，提高了科研效率和科研经费的使用效率；为探讨iIELs的免疫调节机理及作用提供了非常有利的技术工具；此分离方法流程简单，价格低廉，无需特殊的试剂盒仪器设备，极易推广应用。
图I本发明实施例I的流式细胞仪检测结果
具体实施例方式下面通过以下实施例对本发明进行进一步的具体描述实施例I第一步，实验动物的选择选择SPF级的健康的6 8周大鼠(雌雄不限)，实验前禁食(撤掉食物，只给饮水)过夜14小时。第二步，小肠组织的提取及处理将禁食过的大鼠放入密闭的容器中，通入C02气体5-10分钟处死动物后，迅速剖腹，剪取胃的幽门下段Icm处至盲肠上段Icm处的全部小肠，小心剥离肠系膜，并置于盛有30ml O. OlmM PBS的培养皿中。并通过20ml的注射器利用PBS反复清洗肠道2遍，以去除肠道内的内容物及粘液。用弯剪自肠道的浆膜面逐一剪去整个肠段中的peyer’s结,将已剪掉peyer’s结的小肠组织置于盛有4°C保存的15ml含有10%小牛血清和I %青链霉素双抗PBS的培养皿中，冰浴2小时。 第三步，肠上皮间淋巴细胞(iIELs)的分离利用37°C预热的15 20ml含有ImMDTT和10%小牛血清的DMEM培养基，反复冲洗步骤二中冰浴后的小肠组织肠腔2遍，并用弯镊子顺着肠道轻轻将肠腔中的粘液及部分细胞挤出。收集上述DMEM液体于50ml离心管中，室温条件下静置15分钟，带粘液沉至管底后，用毛细管轻轻吸取上清于另一 50ml离心管中，2500rpm/min离心10分钟。弃上清后,加入2ml小牛血清重悬细胞,使细胞悬液滤过100目的钢丝筛网后,利用毛细管将含有细胞的小牛血清缓慢地加入到装有2ml大鼠淋巴细胞分离液(天津好养生物制品有限责任公司，货号LTS1083)的15ml离心管中，使淋巴细胞分离液与小牛血清细胞悬液中间保持明显的分层。放入离心机中，2000rpm/min离心15分钟(注意升降速度调节至lj“4”，以保证分离层不被破坏)。用毛细管小心吸取分离层界面中的白色絮状淋巴细胞于一个干净的15ml离心管中，加入5ml O. OlmM PBS混勻，2500rpm/min离心10分钟，弃上清后再用PBS清洗一遍，以洗去细胞中的淋巴细胞分离液。第四步，iIELs的鉴定利用胎盘蓝对分离获得的淋巴细胞进行染色，显微镜下观察计数细胞活性，分离得到的淋巴细胞存活率高达80%以上。同时，利用APC标记的CD3、FITC标记的⑶8和PE标记的TCR γ δ抗大鼠抗体对分离的淋巴细胞进行染色，流式细胞仪进行检测鉴定。以⑶3+标记的T淋巴细胞圈门，其中⑶8+Τ淋巴细胞比例达到95%，而有30%是⑶8+TCRY δ +双阳性T淋巴细胞，见图I所示，这种检测结果完全符合iIELs的表性特征。实施例2参数选择如表I所示，其它操作步骤同实施例I。
权利要求
1.一种淋巴细胞分离方法，其特征在于所述分离方法是利用温差法与淋巴细胞分离液相结合的方法。
2.根据权利要求I所述淋巴细胞分离方法，其特征在于所述淋巴细胞是肠上皮间淋巴细胞。
3.根据权利要求I或2所述淋巴细胞分离方法，所述温差法是指待分离细胞在0-5°C冰浴后，在0-5min内转移到30-40°C培养基中。
4.根据权利要3所述淋巴细胞分离方法，所述温差法是指待分离细胞在4°C冰浴后，瞬间转移到37°C培养基中。
5.根据权利要求3所述淋巴细胞分离方法，所述冰浴时间为1-4小时。
6.根据权利要求5所述淋巴细胞分离方法，所述冰浴时间为2小时。
7.根据权利要求3或5所述淋巴细胞分离方法，所述培养基是含有ImM二硫代苏糖醇和10%小牛血清的DMEM培养基。
8.根据权利要求7所述淋巴细胞分离方法，所述淋巴细胞来源于大鼠小肠组织。
9.根据权利要求8所述淋巴细胞分离方法，其特征在于由以下步骤组成 小肠组织的提取和处理将禁食过夜的健康大鼠处死后，提取小肠组织，并用PBS冲洗肠腔，剪去peyer’ s结后，置于含有10%小牛血清、I %青链霉素双抗的PBS中冰浴； iIELs的分离利用30-40°C预热的含有ImM 二硫代苏糖醇和10%小牛血清的DMEM培养基反复冲洗小肠组织肠腔，顺着肠道轻轻挤出肠腔中内容物； 静置后离心，利用大鼠淋巴细胞分离液分离iIELs ； 所获得的iIELs的鉴定通过胎盘蓝染色检测iIELs的活性，利用抗大鼠的APC-⑶3、FITC-⑶8和PE-TCR Y δ荧光抗体进行染色，通过流式细胞仪进行鉴定。
全文摘要
本发明提供了一种淋巴细胞分离方法，其特征在于所述分离方法是利用温差法与淋巴细胞分离液相结合的方法。本发明分离的淋巴细胞，存活率高，能达到90％以上。且本法简单易行，耗时少，提高了科研效率和科研经费的使用效率；为探讨iIELs的免疫调节机理及作用提供了非常有利的技术工具；此分离方法流程简单，价格低廉，无需特殊的试剂盒仪器设备，极易推广应用。
文档编号C12N5/0783GK102796703SQ20121033682
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者陈洁, 刘霞, 徐鹏辉, 李廷玉, 魏小平 申请人:重庆医科大学附属儿童医院