专利名称：一种全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，属于食品精深加工技术和功能性食品领域。
背景技术：
蛋白质经过蛋白酶水解得到的肽类物质具有广泛的生物活性，如抗氧化、抑菌、降血压、降血糖、提高免疫力等。活性肽的生物活性一般高于氨基酸，其活性强弱主要与分子量的大小、氨基酸的组成和序列有关。一般来说，蛋白质的水解度越高，活性肽的分子量越低，生物活性越强。近期研究发现，常规酶解法制备的肽类可表现很好的体外活性，但是在体内却活性很低甚至没有活性，研究认为这可能是活性肽在活体内经肠胃消化后被降解，从而失去其原有的生物活性。
本实验室建立了人体全仿生消化模型来评价食品中某物质的生物可利用性，得到启示可利用人体全仿生消化模型法来水解蛋白质，从该蛋白水解液中分离制备的活性肽分子量大小适中，生理活性高，具有较好的抗体内水解性。
发明内容
本发明的目的是提供一种全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，该方法是一种制备高活性、高抗水解性的活性肽的体外模型法；主要是建立人体口、胃和肠的全仿生消化模型，来仿生消化蛋白质，制备高生物活性肽类，与动物模型相比，建立体外全仿生消化模型来制备活性肽，更为可靠、简便和易行。本发明为实现以上目的，采用的技术方案如下
以来源于植物、动物或菌类的蛋白质为原料，模仿蛋白质进入人体所经历的水解过程，即建立全仿生消化系统(包括唾液、胃液和十二指肠液三个过程)模型，然后将原料依次通过人体全仿生消化系统对蛋白质进行水解，每个过程料液比为I :5 I :50，保温35 38°C，模拟咀嚼、肠胃蠕动的频率进行搅拌，唾液水解过程进行2 8min，胃液和肠液的水解过程分别进行30 180min,肠液水解结束前30min,加入原料重量I 3%活性炭,水解结束后，升温至85 100°C，保温3 8min，钝化酶活，冷却，超滤，超滤液经大孔树脂分离纯化后，制备高活性、高抗性的活性肽。本发明中人体唾液仿生消化系统中唾液的制备过程为在500ml O. 02mol/L的磷酸盐或碳酸盐缓冲液中，添加O. 05gNa0H、1.50 2. 00 g KC1、0. 2 g尿素、290 mg α-淀粉酶、15 mg尿酸和25 mg粘蛋白，混合均匀后，用HCl调整pH为6. 6 7. O。本发明中人体胃液仿生消化系统中胃液的制备过程为在500ml O. 02mol/L的氯化钾-盐酸缓冲液或甘氨酸-盐酸缓冲液中添加O. 5 g CaCl2、0. 6 g葡萄糖、O. 33 g氨基葡萄糖盐酸盐、I g牛血清白蛋白、2. 5 g胃蛋白酶和3 g粘蛋白，混合均匀后，用HCl调整pH 为 I. 2 2. O。本发明中人体十二指肠仿生消化系统中十二指肠液的制备过程为在500 ml 0.01mol/L NaHCO3-KH2PO^f 冲液或碳酸盐缓冲液，添加 5 g NaCUO. 05 g MgCl2、0· I g尿素、O. 2g CaCl2U g牛血清白蛋白、9 g胰酶和I. 5 g脂肪酶，混合均匀后，用HCl调整pH为7. 8 8. 2。本发明中超滤的分子量范围为2000 10000 Da。根据本实验室的相关研究结果，本发明技术方案的提出基于下述原理
I)本技术方案基于食物中某成分在人体内生物可利用性的概念(bioaccessibility ),即食物中某成分经人体口、胃和肠消化后，能够存在于消化液中的部分，才可能被人体吸收和利用。所以，体外模拟人体口、胃和肠的消化过程对蛋白质进行消化后，存在于超滤液中的肽类即是可能被人体吸收利用的部分。这部分肽类是人体消化液消化得到的，被人体食用后也不会再被降解而失去原有的结构，也就是具有体内的抗消化性(即高抗性)。2)分子量范围在2000 10000 Da范围内的肽类具有高的抗氧化活性，所以在分 离纯化之前采用2000 10000 Da分子量范围的超滤。本发明相对于现有技术的优点是提供了一种简便、易操作的制备活性高、稳定性好的生物肽的方法。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例I :全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，具体操作如下
以市售花生籽仁蛋白质20 g为原料，同时建立人体全仿生消化系统模型，该消化系统模型包括唾液、胃液和十二指肠液三个过程，将原料依次通过人体全仿生消化系统进行水解，每个过程料液比为I :5，38°C保温，模拟咀嚼或肠胃蠕动的频率进行搅拌(100r mirT1)，仿生唾液水解8min,仿生胃液水解90min,十二指肠液水解180min,在十二指肠液水解进行到150min时,加入蛋白质重量I. 0%的活性碳,继续水解30min,升温至85 V,保温8min,钝化酶活，超滤过膜，分子量为10000 Da，超滤液通过NKA-9大孔树脂进行分离纯化，得到高活性、高抗性的活性肽；
其中唾液的制备过程为在IOOml O. 02mol/L的磷酸盐缓冲液中，添加O. OIgNaOH,O. 3gKC1、0.04 g尿素、58 mg α-淀粉酶、3 mg尿酸和5 mg粘蛋白，混合均勻后,用HCl调整pH为 6.6 ;
胃液的制备过程为在IOOml O. 02mol/L的氯化钾-盐酸缓冲液中添加O. I g CaCl2'
O.12 g葡萄糖、O. 066 g氨基葡萄糖盐酸盐、O. 2 g牛血清白蛋白、O. 5g胃蛋白酶和O. 6 g粘蛋白，混合均匀后，用HCl调整pH为I. 2 ;
十二指肠液的制备过程为在100 ml 0.01 mol/L NaHCO3-KH2PO4缓冲液，添加I gNaCUO. 01 g MgCl2^O. 02 g尿素、O. 04g CaCl2、0. 2 g牛血清白蛋白、I. 8 g胰酶和O. 3 g脂肪酶，混合均匀后，用HCl调整pH为7.8。通过本实施例方法制得的活性肽在羟自由基清除能力评价模型中的IC5tl值为380μ g/ml0
实施例2 :全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，具体操作如下以市售鱼皮蛋白质20 g为原料，同时建立人体全仿生消化系统模型，该消化系统模型包括唾液、胃液和十二指肠液三个过程，将原料依次通过人体全仿生消化系统进行水解，每个过程料液比为I :50，在35°C保温，模拟咀嚼或肠胃蠕动的频率进行搅拌(100r mirT1)，仿生唾液水解2min,仿生胃液水解30min,十二指肠液水解30min,十二指肠液水解开始时,加入蛋白质重量3%的活性炭，水解30min，升温至100°C保温3min，钝化酶活，冷却，超滤过膜，分子量为2000 Da，超滤液通过DA201-C大孔树脂进行分离纯化，得到高活性、高抗性的活性肽；
其中唾液的制备过程为在IOOOml O. 02mol/L的磷酸盐缓冲液中，添加O. lgNaOH、4gKCl、0.4g尿素、580 mg α-淀粉酶、30 mg尿酸和50 mg粘蛋白，混合均匀后，用HCl调整PH 为 7 ;
胃液的制备过程为在IOOOml O. 02mol/L的氯化钾-盐酸缓冲液中添加I g CaCl2U. 2g葡萄糖、O. 66g氨基葡萄糖盐酸盐、2 g牛血清白蛋白、5g胃蛋白酶和6g粘蛋白，混合均勻 后，用HCl调整pH为1.5 ;
十二指肠液的制备过程为在1000 ml 0.01 mol/L NaHCO3-KH2PO4缓冲液，添加10 gNaCUO. Ig MgCl2、O. 2g尿素、O. 4 g CaCl2、2g牛血清白蛋白、18 g胰酶和3g脂肪酶，混合均匀后，用HCl调整pH为8。通过本实施例方法制得的活性肽在抑制ACE酶活性评价模型中的IC5tl值为422μ g/ml0
实施例3 :全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，具体操作如下
以提取自竹荪的蛋白质20 g为原料(采用水提盐析法制备蛋白质)，同时建立人体全仿生消化系统模型，该消化系统模型包括唾液、胃液和十二指肠液三个过程，将原料依次通过人体全仿生消化系统进行水解，每个过程料液比为I :25，在37°C保温，模拟咀嚼或肠胃蠕动的频率进行搅拌(100r mirT1)，仿生唾液水解5min，仿生胃液水解90min，十二指肠液水解120min,在十二指肠液水解进行到90min时,加入蛋白质重量I. 5%的活性碳,继续水解30min,升温至90°C保温5min，钝化酶活，超滤过膜，分子量为3000 Da,超滤液通过AB-8大孔树脂进行分离纯化，得到高活性、高抗性的活性肽；
其中唾液的制备过程为在500ml O. 02mol/L的磷酸盐或碳酸盐缓冲液中，添加
0.05gNa0HU.8 g KC1、0. 2 g尿素、290 mg α-淀粉酶、15 mg尿酸和25 mg粘蛋白，混合均匀后，用HCl调整pH为6.8 ;
胃液的制备过程为在500ml O. 02mol/L的氯化钾-盐酸缓冲液或甘氨酸_盐酸缓冲液中添加O. 5 g CaCl2、0.6 g葡萄糖、O. 33 g氨基葡萄糖盐酸盐、I g牛血清白蛋白、2. 5 g胃蛋白酶和3 g粘蛋白，混合均匀后，用HCl调整pH为2.0 ;
十二指肠液的制备过程为在500 ml 0.01 mol/L NaHCO3-KH2PO4缓冲液或碳酸盐缓冲液，添加5 g NaCUO. 05 g MgCl2、0. I g尿素、O. 2 g CaCl2U g牛血清白蛋白、9 g胰酶和
1.5 g脂肪酶，混合均匀后，用HCl调整pH为8. 2。通过本实施例方法制得的活性肽在羟自由基清除能力评价模型中的IC5tl值为110μ g/ml0
权利要求
1.一种全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，其特征在于首先建立人体全仿生消化系统模型，该消化系统模型包括唾液、胃液和十二指肠液三个过程，然后以来源于植物、动物或菌类的蛋白质为原料，并将该原料依次通过人体全仿生消化系统对蛋白质进行水解，每个过程料液比为I :5 I :50，在35 38°C保温，模拟咀嚼或肠胃蠕动的频率进行搅拌，唾液水解过程进行2 8min，胃液和肠液的水解过程分别进行30 180min，肠液水解结束前30min，加入原料重量I 3%的活性炭，水解结束后，升温至85 100°C，保温3 8min,钝化酶活，冷却，超滤，超滤液经大孔树脂分离纯化后，得到高活性、高抗性的活性肽。
2.根据权利要求I所述的全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，其特征在于 人体唾液仿生消化系统中唾液的制备过程为在500ml O. 02mol/L的磷酸盐或碳酸盐缓冲液中，添加 O. 05gNa0H、l. 50 2. 00 g KC1、0. 2 g 尿素、290 mg α-淀粉酶、15 mg 尿酸和 25mg粘蛋白，混合均匀后，用HCl调整pH为6. 6 7. O。
3.根据权利要求I所述的全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，其特征在于人体胃液仿生消化系统中胃液的制备过程为在500ml O. 02mol/L的氯化钾-盐酸缓冲液或甘氨酸-盐酸缓冲液中添加O. 5 g CaCl2^O. 6 g葡萄糖、O. 33 g氨基葡萄糖盐酸盐、I g牛血清白蛋白、2. 5 g胃蛋白酶和3 g粘蛋白，混合均匀后，用HCl调整pH为I. 2 2. O。
4.根据权利要求I所述的全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，其特征在于人体十二指肠仿生消化系统中十二指肠液的制备过程为在500 ml O. 01 mol/LNaHCO3-KH2POjl冲液或碳酸盐缓冲液，添加 5 g NaCUO. 05 g MgCl2、0. I g 尿素、O. 2 gCaCl2U g牛血清白蛋白、9 g胰酶和I. 5 g脂肪酶，混合均匀后，用HCl调整pH为7. 8 8. 2。
5.根据权利I所述的全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，其特征在于超滤的分子量范围为2000 10000 Da。
全文摘要
本发明公开了一种仿生消化模型法制备活性肽的制备方法，以来源于植物、动物或菌类的蛋白质为原料，以全仿生消化系统，包括唾液、胃液和十二指肠液，进行水解，水解液通过超滤过膜，并进一步通过大孔树脂进行分离纯化后，制备高活性、高抗性的活性肽，该方法简单易操作。
文档编号A23J3/30GK102823715SQ20121034713
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者庄永亮, 张玉锋, 刘蒙蒙, 孙丽平 申请人:昆明理工大学