专利名称：黄麻链霉菌nf0919菌株代谢产物在葡萄病害防治上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种黄麻链霉菌iStreptomycesmrdor狀ii)NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，及提取物在葡萄病害防治上的应用，属于生物农药技术领域。
背景技术：
由植物病原真菌围小丛壳菌(Mlomerella ci/ 济侵染引发的葡萄炭疽病、囊孢壳菌iPhysalospora侵染引发的葡萄房枯病、链格孢菌iAlternaria viticola)引发的葡萄穗轴褐腐(枯)病、Coniothyrium dlodiella侵染引发的葡萄白腐病、单轴霉属iPlasmopara vi ticola)侵染引发的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌(此cinerea )侵染引发的葡萄灰霉病和痂囊腔菌ampelina)侵染引发的葡萄黑痘病是我国葡萄上发生的主要病害。·葡萄病害当前主要通过化学防治来防控，常用的化学药剂有甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、波尔多液(bordeaux mixture)、五氯酌·钠(sodiumpentachlorophenol)λ 乙酸铜(cupric acetate)、啼菌酯(azoxystrobin)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、啼霉胺(pyrimethanil)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯 B亏菌酯(enestroburin)、氟吗啉(fIumorph)、卩定酸菌胺(boscalid)、甲霜灵(metalaxyl)、霜霉威(propamocarb)、多菌灵(carbendazim)、咪鲜胺(prochloraz)、卩比唑醚菌酯(pyraclostrobin)和烯酰吗啉(dimethomorph)等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造成葡萄病原菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗(耐)药性，生产上屡屡出现防治失败的事例。目前成功用于防治葡萄病害的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治控制葡萄病害的生防菌属(种)主要有(I)木霉菌属真菌Spp.)中的绿色木^ (Trichoderma viride )^ Pp1(Trichoderma harzianum)和长枝木霉舰longi brachi a turn ) ； (2)芽抱杆菌属细菌spp.)中的枯草芽抱杆菌
錯质芽抱杆菌{Bacillus cereus)、多粘芽抱杆菌(抱^77心polymyxa )、巨大芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌amyloliquefaciens)； (3)单格孢菌(Ulocladium atrum) ; (4)链霉菌属细菌焊c^spp.)中的灰绿链霉菌(Streptomyces griseovirides) λ{Streptomyces hygroscopicus)Λ(51 treptomyces aureochromogenes)矛口链霉菌(51 treptomyces kitasazwaensis) ； (5) {叚单胞菌属细菌(户似肌spp.)中的洋葱假单胞菌(Pseudomonas、焚光假单胞
细菌(户似肌和恶臭假单胞菌(户似肌putida)； (6)酵母菌中的季也蒙毕赤氏酵母CPicAia guiIIiermondii)和罗伦隐球酵母Iaurentii)
坐寸O大多数菌株或制剂只能防治一种病害，而利用同一颉颃放线细菌同时兼治葡萄多种病害在现有技术中没有提及和公开。
发明内容
提供黄麻链霉菌iStreptomyces cor chorus ii ) NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，及提取物在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病上的应用。本发明是通过以下技术方案实现的
本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL 201010236886. I。黄麻链霉菌(拉丁文学名为Streptomyces corchorusii) NF0919菌株，已于2010年7月8 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为=CGMCC No. 3968。本发明的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，包括以下步骤
(A)菌株的活化与一级种子培养液的培养
将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30°C培养10 d，挑取I cm2大小的菌块接种于50 mL—级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL)，置于170 rpm摇床上30°C振荡培养44 48 h，其中所述的50 mL—级种子培养液的成分为可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的单位比例为W/V;
(B)二级种子培养液的培养
将步骤(A)所得一级种子培养液按5% (V/V)的接种量接入50 mL 二级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL),170 rpm,30 °C摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V ;所述的50 mL 二级种子培养液的成分(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的单位比例为W/V ；
(C)发酵培养液的培养
将步骤(B)所得二级种子培养液按5% (V/V)的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为溶氧100%，消泡剂I. 6 L，搅拌速度为360 rpm,发酵温度为36 °C，发酵时间为72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的发酵培养液的成分为(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的单位比例为W/V ;所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；
(D)NF0919菌株发酵液中代谢产物分离方法
把步骤(C)所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2. 0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本发明的有益效果是
本发明提供黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，并证明其提取物可同时防治葡萄的果实、叶柄和叶片上的多种病害。大田防治结果表明，该菌株代谢产物对葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和白腐病等葡萄病害均有很好的防治效果。
具体实施方式
实施例本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL201010236886. I。本发明黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，包括以下步骤
(A)菌株的活化与一级种子培养液的培养
将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30°C培养10 d，挑取I cm2大小的菌块接种于50 mL—级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL)，置于170 rpm摇床上30°C振荡培养44 48 h，其中所述的50 mL—级种子培养液的成分为可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的单位比例为W/V。·
(B) 二级种子培养液的培养
将步骤(A)所得一级种子培养液按5% (V/V)的接种量接入50 mL 二级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL),170 rpm,30 °C摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V ;所述的50 mL 二级种子培养液的成分(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白
2.2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的单位比例为W/V。(C)发酵培养液的培养
将步骤(B)所得二级种子培养液按5% (V/V)的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为溶氧100%，消泡剂I. 6 L，搅拌速度为360 rpm,发酵温度为36 °C，发酵时间为72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的发酵培养液的成分为(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的单位比例为W/V ;所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂。(D) NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法
把步骤(C)所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2. 0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本实施例的实施效果
(I )NF0919菌株发酵液的提取物，对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室内毒力测定
NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室内毒力测定方法如下
取适量提取物，用无菌水梯度稀释，制成含提取物浓度分别10、5、2. 5、1.25、O. 625,0 mg/L的PDA平板，并设无菌水为空白对照，对照药剂用化学药剂为98%多菌灵(carbendazim)按上述相同稀释浓度制成含药PDA平板。用直径为4 mm的打孔器分别在长有葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的PDA平板的边缘打取菌饼，将菌饼接种到上述含药(提取物和多菌灵)平板中央，每个病原菌的每个浓度设4个重复。将平板置于25°C保温培养箱中，培养72 h。用十字交叉法测定菌落净生长直径(菌落净生长直径=菌落直径一菌饼直径)，计算抑制率。抑制率=(空白对照菌落净生长直径一含药的菌落净生长直径)/空白对照菌落净生长直径X 100%。用DPS 13. O软件计算毒力回归方程。NF0919发酵液的提取物对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室内毒力测定结果
毒力测定结果表明，NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌菌丝的生长均有强烈抑制作用(表 I)，对 6 个病原菌的 EC5tl 值(表 3)分别为 O. 5514 mg/L、0. 7529 mg/L、I. 4329 mg/L、1.1984 mg/LU. 9479 mg/L和0. 2876 mg/L。相比之下，相同稀释倍数条件下98%多菌灵对葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗轴褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的菌丝生长抑制率(表2)较低，其EC5tl值(表3)分别为1.6830 mg/L、3. 1266 mg/L、 5.2827 mg/LU. 5762 mg/L、7· 1469 mg/L 和 0. 6975 mg/L。NF0919 发酵液活性的提取物对葡萄病原菌的室内毒力极显著高于化学药剂多菌灵。表I. NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄病原菌的平均抑制率
权利要求
1.黄麻链霉菌(Streptomycescor chorus ii') NF0919菌株(该菌种特性见专利ZL201010236886. I)发酵液中代谢产物的提取方法。
2.根据权利要求I所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取物，在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病上的应用。
3.权利要求I所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，其特征在于包括以下步骤 (A)菌株的活化与一级种子培养液的培养 将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30°C培养10 d，挑取I cm2大小的菌块接种于50 mL 一级种子培养液中，置于170 rpm摇床上30°C振荡培养44 48 h,其中所述的50 mL—级种子培养液的成分为可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的单位比例为W/V ； (B)二级种子培养液的培养 将步骤(A)所得一级种子培养液按5%的接种量接入50 mL 二级种子培养液中，170rpm,30 °C摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V ;所述的50 mL 二级种子培养液的成分:马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%, K2HPO4 O. 05%，MgSO4 O. 05%,淀粉酶O. 01%,马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4, MgSO4和淀粉酶含量的单位比例为VV； (C)发酵培养液的培养 将步骤(B)所得二级种子培养液按5%的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为溶氧100%，消泡齐IJ(XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂)1.6 L，搅拌速度为360 rpm,发酵温度为36 V，发酵时间为72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的发酵培养液的成分为马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白·2. 6%, K2HPO4 O. 05%, NaCl O. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4 ,NaCl、MgSO4和CaCO3含量的单位比例为W/V; (D)NF0919菌株发酵液中代谢产物提取方法 把步骤(C)所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2. 0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。
全文摘要
本发明为黄麻链霉菌NF0919菌株(其在CGMCC的保藏编号为CGMCCNo.3968，菌种专利号为ZL201010236886.1)发酵液中活性代谢产物的提取方法。代谢产物能有效防治由植物病原真菌围小丛壳菌(Glomerellacingulata)侵染引发的葡萄炭疽病、囊孢壳菌(Physalosporabaccae)侵染引发的葡萄房枯病、链格孢菌(Alternariaviticola)引发的葡萄穗轴褐腐(枯)病、Coniothyriumdlodiella侵染引发的葡萄白腐病、单轴霉属(Plasmoparaviticola)侵染引发的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)侵染引发的葡萄灰霉病和痂囊腔菌(Elsinaeampelina)侵染引发的葡萄黑痘病等多种植物病害。
文档编号C12R1/465GK102899356SQ20121035462
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月23日 优先权日2012年9月23日
发明者杨敬辉, 陈宏州, 庄义庆 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所