专利名称：一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法。
背景技术：
植酸(PA,phytic acid),又名肌醇六磷酸(myo-inositol-l, 2, 3,4, 5,6-hexakisphosphate,简写InsP6或IP6),广泛存在于禾谷类、豆类、坚果、油料作物的种子中，是植物磷的主要储存形式。在植物体内，植酸及其衍生物承担着多种生理功能，如在种子发育过程中储藏磷、能量等，在种子萌发时向种子提供无机磷。此外，植酸及其衍生物也 参与细胞内的信号转导、能量转换、ATP代谢及抗逆性等过程。然而，由于人和非反刍动物(猪、鸡、鱼等)肠胃内缺乏消化植酸及植酸盐的相关酶，因此以禾谷类、豆类等为主食的人类和饲用动物的排泄物中磷的含量很高，极易造成环境水体富营养化；同时植酸与Zn2+、Ca2+、Fe3+等形成的植酸盐不能被人和非反刍动物所吸收利用，造成这些微营养的生物有效性下降。因此，通过遗传育种或者基因工程技术获得植酸含量适当下降、其他农艺性状没有显著变异的作物，不仅能够提高食物的营养价值，同时对于保护生态环境有重要的社会意义。V. Raboy等(1996)采用化学诱变剂处理玉米，培育了两类低植酸突变体Ipal和lpa2，植酸含量分别下降66%和30%。随后应用Y射线和化学诱变剂在大麦、水稻、小麦、大豆等作物获得了多种植酸突变体和品种，这些突变体和品种的种子植酸含量下降幅度从30到90%不等。然而研究发现，伴随着种子中植酸含量下降，作物的其他农艺性状也会发生改变，如作物减产、种子活力下降、植株形态改变，甚至会影响植物对病原菌的抗性，严重的还会导致致死突变。因此，获得作物种子植酸含量下降而其他农艺性状没有显著变异的低植酸品种成为摆在育种家面前的难题。到目前为止，植物植酸代谢途径已经了解比较清楚，参与植酸代谢的多个功能基因已经被报道。包括将光合作物产物葡萄糖-6-磷酸转化成ID-肌醇-3-磷酸的MIPS基因；负责肌醇和3-磷酸肌醇之间转化的MIK和IMP基因；参与肌醇磷酸化的IPKl和IPK2基因；承担运输植酸到贮藏小泡的MRP5(水稻)基因；将植酸水解为肌醇和无机磷的植酸酶基因。目前功能研究最为详细的是MIPS基因，并通过基因沉默技术在多种作物中获得了相应的低植酸突变体。Ruth Keller等(1998)应用组成型启动子和反义RNA技术，获得了MIPS基因表达水平下降的转基因土豆，分析发现转基因土豆叶片中肌醇的含量下降；AlineC. S. Nunes等(2005)通过RNAi技术沉默MIPS基因使大豆中的植酸含量下降了 94. 5%；MioKuwano等(2008)通过反义RNA技术在种子特异性启动子的驱动下，获得了植酸含量下降、其他农业性状没有显著变异的转基因水稻。此外，Shi等(2007)应用RNAi技术，在玉米种子特异性启动子01el6和Glb驱动下，通过沉默MRP4基因获得种子植酸含量下降的玉米和大豆。目前还没有通过RNAi技术沉默其他植酸代谢相关基因，培育低植酸水稻或其他作物的报道。
发明内容
本发明提供了一种植物表达载体，利用该植物表达载体能特异性地抑制水稻种子中相应植酸代谢相关基因MIK的表达，从而获得性状稳定的低植酸水稻植株。一种RNAi抑制水稻MIK基因表达的植物表达载体，包括插入原始载体的发夹结构单元和特异性启动子，所述特异性启动子为启动子01eOsinl8，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。MIK基因来自于水稻，其基因序列号；LOC 0s03g52760，其序列如SEQ ID No. 8所示。本发明植物表达载体使用种子特异性启动子OleosinlS，可以使基因沉默事件仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效地避免其他组织部位植酸合成受到影响。所述发夹结构单元包括中间的内含子及两端的目的基因片段和目的基因片段的 反向互补片段，所述目的基因片段为MIK基因cDNA序列的部分序列，MIK基因的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。内含子在本发明中没有特异性的要求，它可以来自菜豆亚硝酸还原酶基因(基因序列号U10419. 1)，碱基序列如SEQ ID NO. 3所示。扩增所述目的基因片段的引物为引物MIKRNAi-F和MIKRNAi-R如下MIKRNAi-F :5，-TACTTGAGAAGGCAGTAAAACGAC-3，；MIKRNAi-R :5，-AGAGCACATAATTCAACAGAGAGC-3，；所述原始载体可以是pCAMBIA1301-35SN或其他可用于农杆菌转化的双元载体。本发明还提供了一种培育低植酸水稻的方法，包括(I)构建所述的植物表达载体；(2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；(3)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗，移栽大田，筛选获得低植酸水稻植株。其中，所述植物表达载体的构建方法为(I)构建发夹结构单元；(2)将启动子Oleosin 18替换原始载体的启动子；(3)将发夹结构单元插入启动子Oleosin 18的下游。所述农杆菌可以选择为EHA105根瘤农杆菌。为了获得性状稳定的转基因低植酸植株，可以对获得低植酸水稻植株多代种植。其中发夹结构单元构建过程为(I)提取水稻幼胚总RNA，反转录合成cDNA ；(2)以所述cDNA为模板，利用引物MIKRNAi-F和MIKRNAi-R进行PCR扩增；(3)将pSSK-IN载体和扩增产物经两次双酶切，然后连接获得带发夹结构单元的载体。所述启动子Oleosin 18的制备方法为(I)提取水稻种子总DNA ；(2)以所述总DNA为模板，利用引物01el8_F和01el8_R进行PCR扩增。所述引物01el8_F和01el8_R如下01el8-F:5’ -AAGCTTATGTCTGCCAGCATTGTGAAG-3’ ；
01el8-R :5’ -GGTACCTGCTAAGCTAGCTAGCA AGATGA-3’。与现有技术相比，本发明的有益效果为(I)本发明提供的方法利用种子特异性启动子Oleosin 18控制水稻种子中MIK基因表达，使基因沉默事件仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效避免水稻其他组织部位植酸合成受到影响。(2)利用本发明提供的方法能够获得稳定的转基因低植酸水稻品系，并且与其他非转化阴性系在株高、穗长、千粒重等其他农艺方面无显著差异，保证了转基因低植酸水稻的整体品质。
图IA为01eosinl8_T载体的菌落PCR扩增验证结果图。图IB为MIK-T载体的菌落PCR验证结果图。图2为pSi-MIK载体结构示意图。图3为转化水稻愈伤组织的⑶S显色图。其中，“ + ”表示转基因阳性，表示非 转基因阴性。图4为转基因水稻叶片⑶S显色图。其中，“ + ”表示转基因阳性，表示非转基因阴性。图5为种子无机磷显色反应结果图。其中，“ + ”表示转基因阳性，表示非转基因阴性。
具体实施例方式1、MIK基因片段的扩增(I)总 RNA 提取采用QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒提取日本晴开花后14天幼胚总RNA,具体步骤为①用液氮把样品磨成粉末，转移至自备的I. 5mL离心管中，可直接做下面的步骤或者存于_70°C冰箱中。②称取重量小于IOOmg的样品到离心管中，加入450 μ L RLT或RLC缓冲液(使用前加4. 5 μ L β -巯基乙醇)，剧烈振荡，56°C下温浴3min，涡旋混匀样品。③将溶解的样品转移到紫色回收柱中，HOOOrpm离心2min，将上清液转移至一新的1.5mL离心管中(自备)，不要搅动管底沉淀。④上清液中加入O. 5倍体积的无水乙醇，混匀。⑤将样品转移到粉红色的离心柱中，10，OOOrpm离心15s。⑥弃去收集管中的液体，在回收柱中加入700 μ L缓冲液RW1，IOOOOrpm离心15s。⑦将回收柱转到一新的2mL收集管中，加入500 μ L缓冲液RPE，IOOOOrpm离心15s0⑧再加一次500 μ L RPE缓冲液，HOOOrpm离心2min，之后倒出液体，再空管离心Imin0⑨将回收柱置于一新的I. 5mL离心管中，加入30-50 μ L RNase-free水至膜上，12000rpm离心lmin。加RNase-free水可分为两步,例如先加30 μ L洗一次,再加20 μ L洗一次。(2)反转录采用M-MLV RTase cDNA Synthesis试剂盒反转录生成cDNA。具体步骤为①RNA 预变性10 μ L RNA (200ng/ μ L) +2 μ L Oligo (dT)，65 °C，5min，冰上冷却2min ；②反转录利用预变性后的RNA进行反转录反应。反应完成后，将获得的cDNA在42 V下保温Ih，冰上冷却，备用。反转录体系如下
权利要求
1.一种RNAi抑制水稻MIK基因表达的植物表达载体，包括插入原始载体的发夹结构单元和特异性启动子，其特征在于，所述特异性启动子为启动子Oleosin 18,其核苷酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
2.如权利要求I所述的植物表达载体，其特征在于，所述原始载体为PCAMBIA1301-35SN。
3.如权利要求I所述的植物表达载体，其特征在于，所述发夹结构单元包括中间的内含子及两端的目的基因片段和目的基因片段的反向互补片段，所述内含子的碱基序列如SEQ ID No. 3 所示。
4.如权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，所述MIK基因的核苷酸序列如SEQID NO. 8 所示。
5.一种培育低植酸水稻的方法，其特征在于，包括 (1)构建如权利要求I 4任一所述的植物表达载体； (2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织； (3)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗，移栽大田，筛选获得低植酸水稻植株。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体的构建方法为 (1)构建发夹结构单元； (2)将启动子Oleosin18替换原始载体的启动子； (3)将发夹结构单元插入启动子Oleosin18的下游。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根瘤农杆菌EHA105。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将低植酸水稻植株种植多代，获得性状稳定植株。
全文摘要
本发明公开了一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法，该植物表达载体包括插入原始载体的发夹结构单元和特异性启动子，所述特异性启动子为启动子Oleosin 18，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该方法包括(1)构建所述植物表达载体；(2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；(3)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗，移栽大田，筛选获得低植酸水稻植株。本发明利用种子特异性启动子Oleosin 18控制基因表达，使基因沉默仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效避免水稻其他组织部位植酸合成受到影响。
文档编号C12N15/82GK102864167SQ20121036407
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者舒庆尧, 李文旭, 赵海军 申请人:浙江大学