专利名称：氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒、筛选鉴定及菌样分离方法
技术领域：
本发明属于ー种细菌筛选鉴定方法及试剂盒，特别涉及ー种氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒、筛选鉴定及菌样分离方法。
背景技术：
氨氮是引起水体污染的重要物质之一。目前城市污水中含有大量的氨氮，若直接排放到自然环境中会造成严重的环境污染，导致河流、湖泊的富营养化，使水体自浄能力减弱。生物脱氮是目前废水脱氮中最经济有效的方法之一，而氨氮的转化依赖于硝化微生物的作用。污水生物脱氮包括硝化阶段和反硝化阶段。其中硝化阶段包括两个阶段(I)将NH4+-N 氧化为 N02__N 的氨氧化菌(Ammonia oxidizing bacteria, AOB) ; (2)将 N02__N 氧化为N03_-N的亚硝酸盐氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria, NOB)。经过硝化过程形成的 硝酸盐通过反硝化作用形成氮气逸出水体完成脱氮。在硝化阶段中，由氨氮氧化为亚硝氮的氨氧化过程是整个反应的限速步骤，因此加速氨氧化菌的富集、快速生长是目前急需解决的问题。目前有大量针对氨氧化细菌的筛选、分离培养的研究。专利CN1884480A描述了ー种用牛肉膏培养基进行富集，然后从牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取单菌落，接种到氨氧化培养基获得氨氧化细菌。专利CN 101434905A描述了ー种通过逐步提高氨氮负荷的方法培养能耐受高浓度氨氮负荷的活性污泥，再从活性污泥中分离筛选单菌。专利CN102268386A描述了ー种将污泥进行富集后用硅胶平板进行涂布，挑取单菌落在含甲酚红的平板上划线分纯得到氨氧化细菌。目前各种筛选氨氧化细菌的方法均取得了不错的結果，但是对于氨氧化细菌的筛选鉴定一般均采用人工培养基进行间接验证，没有在污水环境下进行验证或将结果与污水环境进行拟合对比。并且采用传统的验证方法存在工作量大、效率低的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述的缺陷，提供一种氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒、筛选鉴定方法及菌样分离方法；该方法是通过实验设计了一系列人工氨氧化鉴定培养基对微生物进行氨氧化能力鉴定，并且经过与微生物在市政污水、医疗污水中的氨氧化结果进行对比拟合，最終设计出了 3组人工氨氧化鉴定培养基对微生物进行氨氧化效果鉴定，其结果可以百分之百覆盖、模拟微生物在污水环境下的氨氧化效果；该试剂盒是将筛选出的人工鉴定培养基制备成无菌预制管，并结合菌株富集管、氨氧化鉴定管、菌株保藏液，显色剂的一种可以高通量、操作简单、快速的一站式氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于它是由菌株富集管、氨氧化鉴定管1-3、菌株保藏液、显色剂A和显色剂B组成；其中菌株富集管
菌株富集管中装有富集培养基，每升富集培养基所含成分如下硫酸铵250-780mg,葡萄糖0. 8-2. lg，磷酸ニ氢钾480-890mg,磷酸氢ニ钠0. 7-1. 5g，硫酸镁100-200mg,氯化|丐5-5011^,碳酸氢钠20-120mg,微量元素母液A Iml,微量元素母液B Iml,以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00-8. 50 ；富集培养基配制完成并调完pH后，将富集培养基分装到I. 8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入富集培养基0. 8ml，分装完毕后，115°C灭菌20-30min ；氨氧化鉴定管I :氨氧化鉴定管I中装有氨氧化鉴定培养基(1)，每升氨氧化鉴定培养基(I)所含成分如下硫酸铵250-780mg,葡萄糖0. 1-1. 2g,磷酸ニ氢钾480_890mg,磷酸氢ニ钠0. 7-1. 5g，硫酸镁100_200mg，氯化钙5_50mg，碳酸氢钠20_120mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B Iml,以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鉴定培养基(I)配制完成并调完PH后，将氨氧化鉴定培养基(I)分装到I. 8ml螺ロ冻存管中，每
支冻存管加入氨氧化鉴定培养基(I) 0. 8ml，分装完毕后115°C灭菌20-30min ；氨氧化鉴定管2:氨氧化鉴定管2中装有氨氧化鉴定培养基(2)，每升氨氧化鉴定培养基(2)所含成分如下硫酸铵250-780mg，醋酸钠0. 4-1. 2g，磷酸ニ氢钾480_890mg，磷酸氢ニ钠
0.7-1. 5g，硫酸镁100-200mg,氯化钙5_50mg，碳酸氢钠20_120mg，微量元素母液A Iml,微量元素母液B Iml,以上氨氧化鉴定培养基(2)用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鉴定培养基(2)配制完成并调完pH后，将氨氧化鉴定培养基(2)分装到
1.8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入氨氧化鉴定培养基(2)0. 8ml，分装完毕后115°C灭菌20_30min ；氨氧化鉴定管3:氨氧化鉴定管3中装有氨氧化鉴定培养基(3)，每升氨氧化鉴定培养基(3)所含成分如下硫酸铵250-780mg,葡萄糖0-50 mg ;醋酸钠0-50 mg,磷酸ニ氢钾480_890mg,磷酸氢ニ钠0. 7-1. 5g，硫酸镁100-200mg，碳酸钙l_5g，碳酸氢钠20_120mg，微量元素母液Alml，微量元素母液B Iml,以上氨氧化鉴定培养基(3)用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鉴定培养基(3)配制完成并调完pH后，将氨氧化鉴定培养基(3)分装到
I.8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入氨氧化鉴定培养基(3)0. 8ml，分装完毕后115°C灭菌20_30min ；菌株保藏液菌株保藏液成分如下甘油30-50ml,去离子水50-70ml ；显色剂A 显色剂A成分如下对氨基苯磺酸0. 5-0. 8g, 15%醋酸溶液IOOml ；显色剂B:显色剂B成分如下a -萘胺0. 1-0. 3g，15%醋酸溶液IOOml ；其中姆升微量元素母液A所含成分如下硫酸亚铁5g, EDTA ニ钠5g ；其中每升微量元素母液B所含成分如下EDTA ニ钠I. 5g，ZnSO4. 7H20 430mg,CoCl2. 6H20 240mg，MnCl2 629mg，CuSO4. 5H20 250mg，Na2MoO4. 2H20 220mg，NiCl2. 6H20 190mg, H3BO3 14mg。ー种采用氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒进行氨氧化细菌筛选鉴定方法，其特征在于按如下的步骤进行步骤I :待测菌样的准备待测菌样是(a)经过分离的污水、污泥中的菌株；(b)未分离纯化的污水、污泥中的菌群；步骤2 将步骤I准备的待测菌样用接种环或移液器接种至菌株富集管中，菌株富集管中装有富集培养基，将菌株富集管盖拧紧，培养条件选择30-35°C温度下静止12-16小时培养，或将菌株富集管平放入摇床30-35°C、150-200rpm震荡12-16小时培养；步骤3 将步骤2富集的菌株分别接种至氨氧化鉴定管I、氨氧化鉴定管2、氨氧化鉴定管3中，接种量为10-60ul ;将氨氧化鉴定管平放入摇床，在30-35°C、150-200rpm条件下震荡培养 24-48h ；步骤4 接种完毕后向菌株富集管残留的菌液中加入0.8ml菌株保藏液，震荡混匀，放入-20°C冰箱保存；步骤5 步骤3的氨氧化鉴定管经培养24_48h后，分别向氨氧化鉴定管I、氨氧化鉴定管2、氨氧化鉴定管3中滴加显色剂A 2-3滴，充分震荡，再分别加入显色剂B，2-3滴，充分震荡，静置20min后观察颜色变化；颜色变成粉红色或紫红色为氨氧化阳性，用“ + ”表示，颜色无变化为氨氧化阴性，用“一”表示；步骤6 :将步骤5的结果进行记录，显色结果按表I进行比对，得出菌株性能結果。表I :氨氧化鉴定结果分析表
分析结果氨氧化鉴定管I 氨氧化鉴定管2 氨氧化鉴定菅3
无氨氧化功能一__=__- 具有异养氨氧化-=----=- ~~ + 一-—" 具有自养氣氧化_+__~__+_
功能-__+__+
I + ] + r + ー种采用氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒进行氨氧化细菌筛选鉴定方法，其特征在于所说的待测菌样的分离方法按如下的步骤进行步骤I :氨氧化细菌菌样采集培养包括自养氨氧化细菌菌样采集培养和异养氨氧化细菌菌样采集培养；(I)、自养氨氧化细菌菌样采集培养将未分离纯化的污水、污泥中的菌群样品与等体积自养氨氧化细菌菌样培养液混合，放入摇床震荡培养，温度20-30°C，转速150-200rpm,震荡培养5-7天；(2)、异养氨氧化细菌菌样米集培养将未分离纯化的污水、污泥中的菌群样品与等体积异养氨氧化细菌菌样培养液混合，放入摇床震荡培养，温度20_30°C，转速150-200rpm，震荡培养1-3天；
步骤2 培养菌液稀释涂布分离将经步骤1(1)自养氨氧化细菌菌样采集培养的菌液进行梯度稀释至10_4、10_5、10_6、10_7倍，各取SOul接种到自养氨氧化细菌固体分离培养基上进行平板涂布分离，20-30°C培养 5-10 天；将经步骤I (2)异养氨氧化细菌菌样采集培养的菌液进行梯度稀释至10_4、10_5、10_6、10_7倍，各取SOul接种到异养氨氧化细菌固体分离培养基上进行平板涂布分离，20-30°C培养 2-3 天。所说的自养氨氧化细菌菌样培养液是每升自养氨氧化细菌菌样培养液所含成分为硫酸铵400-1200mg，磷酸ニ氢钾480-890mg,磷酸氢ニ钠0. 7-1. 5g，碳酸钙l_10g，碳酸氢钠50_200mg，硫酸镁100_200mg，微量元素母液A Iml,微量元素母液B lml, pH 7.00-8.50。所说的异养氨氧化细菌菌样培养液是每升异养氨氧化细菌菌样培养液所含成分为硫酸铵400-1200mg，葡萄糖
0.5-3. Og,磷酸ニ氢钾480_890mg,磷酸氢ニ钠0. 7-1. 5g,氯化I丐40_120mg,碳酸氢钠50-200mg，硫酸镁100-200mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B lml, pH 7. 00-8. 50 所说的自养氨氧化细菌固体分离培养基是每升自养氨氧化细菌固体分离培养基所含成分为硫酸铵400_1200mg，磷酸ニ氢钾480-890mg，磷酸氢ニ钠0. 7-1. 5g，氯化钙40_120mg，碳酸氢钠50_200mg，硫酸镁200mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，琼脂I. 2%_2. 0%, pH 7. 00-8. 50。所说的异养氨氧化细菌固体分离培养基是每升异养氨氧化细菌固体分离培养基所含成分为硫酸铵400-1200mg，葡萄糖0. 5-3. Og,磷酸ニ氢钾480_890mg,磷酸氢ニ钠0. 7-1. 5g,氯化I丐40_120mg,碳酸氢钠50-200mg,硫酸镁200mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，琼脂I. 2%-2. 0%，pH7. OO-8. 50 o本发明公开的氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒与现有技术相比所具有的优点和有益效果在于具体的说是达到氨氧化细菌快速、高通量筛选鉴定的效果，实现菌种培养、鉴定、保藏ー站式操作；尤其对污水、活性污泥、养殖水、自然水体、土壤中自养及异样氨氧化细菌的筛选有很好的针对性和效果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是操作前应确保操作环境及相关器具已灭菌。本发明所说的原料如无特殊说明均为市售产品。实施例I :自养氨氧化细菌分离、筛选鉴定从活性污泥中筛选自养氨氧化细菌，样品采自天津市海河医院曝气池中的活性污泥，并且采集市政污水作为试剂盒效果对比样品。
步骤I :自养氨氧化细菌菌样采集培养将样品活性污泥与等体积自养氨氧化细菌菌样培养液混合，放入摇床震荡培养，温度27°C，转速180rpm，震荡培养7天；每升自养氨氧化细菌菌样培养液所含成分为硫酸铵578mg，磷酸ニ氢钾730mg，磷酸氢ニ钠I. 10g，碳酸I丐5g,碳酸氢钠60mg,硫酸镁200mg,微量元素母液A Iml,微量元素母液B lml, pH 8. 00 ；步骤2 :培养菌液稀释涂布分离将经步骤I自氧氨氧化培养的菌液进行梯度稀释至lO'lO'lO'lO—7倍，各取SOul接种到自养氨氧化细菌固体分离培养基上进行平板涂布分离，25°C培养7天；每升自养氨氧化细菌固体分离培养基所含成分为硫酸铵578mg，磷酸ニ氢钾730mg,磷酸氢ニ钠I. IOg,氯化I丐50mg,碳酸氢钠60mg,硫酸镁200mg,微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，琼脂2. 0%，pH 8. 00 ；步骤3 :菌株氨氧化能力筛选鉴定a.选取经步骤2平板涂布分离的菌落数在1-300左右的平板，将平板上的单菌落进行标记，共标记237个单菌落，用接种环将单菌落接种到试剂盒中的菌株富集管中，菌株富集管中装有富集培养基，将菌株富集管盖拧紧，平放入摇床30°C、170rpm震荡12-16小时培养；其中每升富集培养基所含成分如下硫酸铵580mg，葡萄糖2. Og,磷酸ニ氢钾680mg，磷酸氢ニ钠I. 0g，硫酸镁150mg,氯化韩30mg,碳酸氢钠80mg,微量元素母液A lml,微量元素母液B lml,以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 50 ;富集培养基配制完成并调完PH后，将富集培养基分装到I. 8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入富集培养基0. 8ml，分装完毕后，115°C灭菌20-30min ；b.将步骤a富集的菌液分别接种至氨氧化鉴定管I、氨氧化鉴定管2、氨氧化鉴定管3中，接种量为20ul，氨氧化鉴定管1、2、3中分别装有氨氧化鉴定培养基1、2、3 ;将氨氧化鉴定管平放入摇床，在30°C、170rpm条件下震荡培养48h ;其中氨氧化鉴定管I中装有氨氧化鉴定培养基(I )，每升氨氧化鉴定培养基(I)所含成分如下硫酸铵780mg,葡萄糖0. Ig,磷酸ニ氢钾480mg,磷酸氢ニ钠0. 7g,硫酸镁IOOmg,氯化I丐5mg,碳酸氢钠20mg,微量兀素母液A lml,微量兀素母液B lml,以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00 ;氨氧化鉴定培养基(I)配制完成并调完pH后，将氨氧化鉴定培养基(I)分装到I. 8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入氨氧化鉴定培养基(I )0. 8ml，分装完毕后115°C灭菌25min ；氨氧化鉴定管2中装有氨氧化鉴定培养基(2)，每升氨氧化鉴定培养基(2)所含成分如下硫酸铵780mg,醋酸钠0. 4g,磷酸ニ氢钾480mg,磷酸氢ニ钠0. 7g,硫酸镁IOOmg,氯化钙5mg，碳酸氢钠20mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，以上氨氧化鉴定培养基(2)用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00 ;氨氧化鉴定培养基(2)配制完成并调完pH后，将氨氧化鉴定培养基(2)分装到I. 8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入氨氧化鉴定培养基(2) 0. 8ml，分装完毕后115°C灭菌25min ；氨氧化鉴定管3中装有氨氧化鉴定培养基(3)，每升氨氧化鉴定培养基(3)所含成分如下硫酸铵780mg,磷酸ニ氢钾480mg,磷酸氢ニ钠0. 7g,硫酸镁IOOmg,碳酸I丐2g,碳酸氢钠20mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，以上氨氧化鉴定培养基(3)用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00 ;氨氧化鉴定培养基(3)配制完成并调完pH后，将氨氧化鉴定培养基(3)分装到I. 8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入氨氧化鉴定培养基(3)0. 8ml,分装完毕后115°C灭菌25min ；c.将市政污水作为试剂盒效果对比样品市政污水COD为152 mg/L,氨氮为25. 3 mg/L,分装至2ml冻存管中，分装量0. 8ml/g管，115°C灭菌25min ;将步骤a富集的菌液接种至市政污水中，接种量为20ul，将冻存管平放入摇床，在30°C、170rpm条件下震荡培养48h ；d.接种完毕后，向步骤a囷株g集管中剩余的囷液加入0. 8ml囷株保减液，震汤混匀，放入_20°C冰箱保存；e.氨氧化鉴定管及污水对照分别向经步骤b和c培养48h后的氨氧化鉴定管I、2、3和市政污水管中滴加显色剂A 2-3滴，充分震荡，再分别加入显色剂B 2-3滴，充分震荡，静置20min后观察颜色变化；颜色变成粉红色或紫红色为氨氧化阳性，用“ + ”表示，顔色无变化为氨氧化阴性，用“一”表示；f.结果分析经过显色反应，237株单菌落中共有38株产生阳性反应，阳性结果见表2 :表2 :海河医院自养氨氧化细菌阳性结果表~氨氧化鉴污 ~氨氧化鉴污 —定_管—水—定_管—水
I"I 2「3 I I I 2 T 3 I
权利要求
1. 一种氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于它是由菌株富集管、氨氧化鉴定管1-3、菌株保藏液、显色剂A和显色剂B组成；其中 菌株富集管 菌株富集管中装有富集培养基，每升富集培养基所含成分如下硫酸铵250-780mg，葡萄糖O. 8-2. Ig,磷酸ニ氢钾480-890mg，磷酸氢ニ钠O. 7-1. 5g，硫酸镁100_200mg，氯化钙5-50mg，碳酸氢钠20-120mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00-8. 50 ； 富集培养基配制完成并调完PH后，将富集培养基分装到I. 8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入富集培养基O. 8ml，分装完毕后，115°C灭菌20_30min ； 氨氧化鉴定管I : 氨氧化鉴定管I中装有氨氧化鉴定培养基(I )，每升氨氧化鉴定培养基(I)所含成分如下硫酸铵250-780mg，葡萄糖O. 1-1. 2g，磷酸ニ氢钾480_890mg，磷酸氢ニ钠O. 7-1. 5g，硫酸镁100-200mg，氯化钙5-50mg，碳酸氢钠20_120mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液BIml,以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鉴定培养基(I)配制完成并调完PH后，将氨氧化鉴定培养基(I)分装到1.8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入氨氧化鉴定培养基(I) O. 8ml，分装完毕后115°C灭菌20_30min ； 氨氧化鉴定管2 氨氧化鉴定管2中装有氨氧化鉴定培养基(2)，每升氨氧化鉴定培养基(2)所含成分如下硫酸铵250-780mg，醋酸钠O. 4-1. 2g，磷酸ニ氢钾480_890mg，磷酸氢ニ钠O. 7-1. 5g，硫酸镁100-200mg，氯化钙5-50mg，碳酸氢钠20_120mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液BIml,以上氨氧化鉴定培养基(2)用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鉴定培养基(2)配制完成并调完pH后，将氨氧化鉴定培养基(2)分装到1.8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入氨氧化鉴定培养基(2) O. 8ml，分装完毕后115°C灭菌20_30min ； 氨氧化鉴定管3 氨氧化鉴定管3中装有氨氧化鉴定培养基(3)，每升氨氧化鉴定培养基(3)所含成分如下硫酸铵250-780mg,葡萄糖0-50 mg,醋酸钠0-50 mg,磷酸ニ氢钾480_890mg,磷酸氢ニ钠O. 7-1. 5g，硫酸镁100-200mg，碳酸钙l_5g，碳酸氢钠20_120mg，微量元素母液Alml，微量元素母液B Iml,以上氨氧化鉴定培养基(3)用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至,7.00-8. 50 ;氨氧化鉴定培养基(3)配制完成并调完pH后，将氨氧化鉴定培养基(3)分装到I.8ml螺ロ冻存管中，每支冻存管加入氨氧化鉴定培养基(3)0. 8ml，分装完毕后115°C灭菌,20_30min ； 菌株保藏液 菌株保藏液成分如下甘油30-50ml,去离子水50-70ml ； 显色剂A 显色剂A成分如下对氨基苯磺酸O. 5-0. 8g, 15%醋酸溶液IOOml ； 显色剂B 显色剂B成分如下:α -萘胺O. 1-0. 3g，15%醋酸溶液IOOml ； 其中 每升微量元素母液A所含成分如下硫酸亚铁5g，EDTA ニ钠5g ；其中 每升微量元素母液B所含成分如下=EDTA ニ钠I. 5g，ZnSO4. 7H20 430mg, CoCl2. 6H20240mg，MnCl2 629mg，CuSO4. 5H20 250mg，Na2MoO4. 2H20 220mg，NiCl2. 6H20 190 mg, H3BO314mg。
2.ー种采用权利要求I所述的氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒进行氨氧化细菌筛选鉴定方法，其特征在于按如下的步骤进行 步骤I :待测菌样的准备 待测菌样是 Ca)经过分离的污水、污泥中的菌株； (b)未分离纯化的污水、污泥中的菌群； 步骤2 将步骤I准备的待测菌样用接种环或移液器接种至菌株富集管中，菌株富集管中装有富集培养基，将菌株富集管盖拧紧，培养条件选择30-35°C温度下静止12-16小时培养，或将菌株富集管平放入摇床30-35°C、150-200rpm震荡12-16小时培养； 步骤3 将步骤2富集的菌株分别接种至氨氧化鉴定管I、氨氧化鉴定管2、氨氧化鉴定管3中，接种量为10-60ul ;将氨氧化鉴定管平放入摇床，在30-35°C、150-200rpm条件下震荡培养24-48h ； 步骤4 : 接种完毕后向菌株富集管残留的菌液中加入O. 8ml菌株保藏液，震荡混匀，放入_20°C冰箱保存； 步骤5 步骤3的氨氧化鉴定管经培养24-48h后，分别向氨氧化鉴定管I、氨氧化鉴定管2、氨氧化鉴定管3中滴加显色剂A 2-3滴，充分震荡，再分别加入显色剂B，2-3滴，充分震荡，静置20min后观察颜色变化；颜色变成粉红色或紫红色为氨氧化阳性，用“ + ”表示，顔色无变化为氨氧化阴性，用“一”表示； 步骤6 :将步骤5的结果进行记录，显色结果按表I进行比对，得出菌株性能結果。
表I :氨氧化鉴定结果分析表
3.ー种采用权利要求2所述氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒进行氨氧化细菌筛选鉴定方法，其特征在于所说的待测菌样的分离方法按如下的步骤进行 步骤I : 氨氧化细菌菌样采集培养包括自养氨氧化细菌菌样采集培养和异养氨氧化细菌菌样采集培养； (1)、自养氨氧化细菌菌样采集培养将未分离纯化的污水、污泥中的菌群样品与等体积自养氨氧化细菌菌样培养液混合，放入摇床震荡培养，温度20-30°C，转速150-200rpm，震荡培养5-7天； (2)、异养氨氧化细菌菌样采集培养将未分离纯化的污水、污泥中的菌群样品与等体积异养氨氧化细菌菌样培养液混合，放入摇床震荡培养，温度20-30°C，转速150-200rpm，震荡培养1-3天； 步骤2 培养菌液稀释涂布分离 将经步骤I (I)自养氨氧化细菌菌样采集培养的菌液进行梯度稀释至10_4、10_5、10_6、10_7倍，各取SOul接种到自养氨氧化细菌固体分离培养基上进行平板涂布分离，20-30°C培养5-10天； 将经步骤I (2)异养氨氧化细菌菌样采集培养的菌液进行梯度稀释至10_4、10_5、10_6、10_7倍，各取SOul接种到异养氨氧化细菌固体分离培养基上进行平板涂布分离，20-30°C培养2-3天。
4.如权利要求3所述的菌样分离方法，其特征在于所说的自养氨氧化细菌菌样培养液是 每升自养氨氧化细菌菌样培养液所含成分为硫酸铵400-1200mg，磷酸ニ氢钾480-890mg,磷酸氢ニ钠O. 7-1. 5g，碳酸钙l_10g，碳酸氢钠50_200mg，硫酸镁100_200mg，微量元素母液A Iml,微量元素母液B lml, pH 7.00-8.50。
5.如权利要求3所述的菌样分离方法，其特征在于所说的异养氨氧化细菌菌样培养液是 每升异养氨氧化细菌菌样培养液所含成分为硫酸铵400-1200mg，葡萄糖O. 5-3. 0g，磷酸ニ氢钾480-890mg，磷酸氢ニ钠O. 7-1. 5g，氯化钙40_120mg，碳酸氢钠50_200mg，硫酸镁100-200mg，微量元素母液A lml，微量元素母液B lml, pH 7. 00-8. 50
6.如权利要求3所述的菌样分离方法，其特征在于所说的自养氨氧化细菌固体分离培养基是 每升自养氨氧化细菌固体分离培养基所含成分为硫酸铵400-1200mg，磷酸ニ氢钾480-890mg，磷酸氢ニ钠O. 7-1. 5g，氯化钙40_120mg，碳酸氢钠50_200mg，硫酸镁200mg，微量元素母液 A 1ml，微量元素母液 B 1πι1，·—1·2%-2·0%，ρΗ 7. 00-8. 50
7.如权利要求3所述的菌样分离方法，其特征在于所说的异养氨氧化细菌固体分离培养基是 每升异养氨氧化细菌固体分离培养基所含成分为硫酸铵400-1200mg，葡萄糖O.5-3. Og,磷酸ニ氢钾480-890mg,磷酸氢ニ钠O. 7-1. 5g,氯化·丐40_120mg,碳酸氢钠50-200mg,硫酸镁200mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，琼脂L 2%-2. 0%，pH.7.00-8.50。
全文摘要
一种氨氧化细菌筛选鉴定试剂盒、筛选鉴定及菌样分离方法，试剂盒包括菌株富集管；氨氧化鉴定管1、2、3；菌株保藏液；显色剂A、B；筛选鉴定方法是将待检测菌种经菌株富集管富集后接种到氨氧化鉴定管1、2、3培养，同时用菌株保藏液将富集菌液保存；氨氧化鉴定管经培养后加入显色剂A、B，根据显色状态判断菌株氨氧化能力，菌样分离方法是将培养菌样稀释涂布分离。本发明的优点是实现氨氧化细菌快速、高通量筛选鉴定的效果，实现菌种培养、鉴定、保藏一站式操作。
文档编号C12Q1/04GK102864075SQ20121038136
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者李博智, 武震, 宋文军, 魏纪平, 朱高雄 申请人:天津市兴源环境技术工程有限公司, 天津清鉴生物科技有限公司