专利名称：一种3’-cDNA展示方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种3’ -CDNA展示方法。
背景技术：
对不同生物不同发育阶段的基因表达状况进行遗传分析，可以为研究生命活动过程提供十分重要的信息，研究基因在特定时期转录水平上的差异表达及表达丰度等情况。目前已有多种可在转录水平对差异表达基因筛选分析的方法，如DDRT-PCR、cDNA-AFLP和SSH等。但冗余度、假阳性高等问题依然制约着这些技术的广泛应用。mRNA 差异显不聚合酶链式反应技术(differential display of mRNA reversetranscription polymerase chain reaction, DDRT PCR),是由 Liang 等首先建立的。此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因，在植物研究方面已经取得了很多成果。现有技术一的缺点是假阳性高，效率较低。cDNA-AFLP是Bachem等在一种应用于基因组DNA的选择性扩增限制性片段即(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)的基础上设计出来的用于 RNA 指纹分析的方法。它将RT2PCR和AFLP结合起来，由于PCR中使用较高的退火温度和应用特定引物对包含信息较多的内部特异片段进行选择性扩增，增加了反应条件的严谨度，使其比DDRT-PCR的可靠性和可重复性大大提高。SSH的基本原理是利用消减杂交和两次抑制PCR，使差异表达基因的cDNA片段得到高度富集，从而实现对差异表达基因的分离和克隆。消减杂交运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而在杂交过程中，使丰度高的单链cDNA杂交形成双链，在杂交完毕后，原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化的目的。抑制PCR是利用DNA链内退火优于链间退火，且比链间退火更稳定的动力学特性，使非目的系列片段两端反向重复序列在退火时产生类似“锅柄”的结构，无法与引物配对不能扩增，从而选择性富集目的基因序列片段。现有技术二的缺点是无法处理多个样本多个时期的mRNA差异表达研究。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种3’ -cDNA展示方法，旨在解决假阳性高，效率较低，无法处理多个样本多个时期的mRNA差异表达研究的问题。本发明实施例是这样实现的，一种3’ -cDNA展示方法，其特征在于，该方法的主要步骤包括(I)以总RNA或者mRNA为模板，以设计合成的Oligo (dT) 18V引物通反转录合成cDNA双链；(2)将步骤⑴得到产物通过Taq I内切酶进行酶切；
(3)将步骤⑵产物与设计合成的“Y”形接头用T4连接酶连接；(4)以Oligo (dT)18V及Taq I “Y”形接头序列设计引物进行PCR扩增。(5)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。进一步，所述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法进一步包括(I)以总RNA或者mRNA为模板，以设计合成的Oligo (dT) 18V引物通过反转录合成cDNA双链；(2)将步骤⑴得到产物通过Taq I内切酶进行酶切，得到两端具有粘性末端的cDNA片段及一端为粘性末端另一端为PolyA末端的cDNA片段；(3)将步骤⑵产物与设计合成的“Y”形接头用T4连接酶连接，得到两种产物，一 种是两端都连接上“Y”形接头的片段，另一种是一端连接上“Y”形接头一端具有PolyA末端的cDNA片段；(4)以Oligo (dT)18V及Taq I“Y”形接头序列设计引物进行PCR扩增，其结果是两端都连接上“Y”形接头的片段在PCR扩增中因其片段两尾的互补序列而形成锅柄状结构，扩增受到抑制；而一端连接上“Y”形接头一端具有PolyA末端的cDNA片段在扩增中得到正常指数扩增。进一步，所述展示方法应用“Y”形接头与酶切片段连接，抑制非PolyA末端的cDNA扩增，让具有“Y”形接头及PolyA末端的cDNA得到指数扩增，排除了非PolyA末端cDNA的干扰，从而只扩增cDNA 3’末端序列。本发明应用“Y”形接头与酶切片段连接，抑制非PolyA末端的cDNA扩增，让具有“Y”形接头及PolyA末端的cDNA得到指数扩增，排除了非PolyA末端cDNA的干扰。因此，本发明方法能够展示基于mRNA水平的基因表达谱，可用来筛选差异表达基因。方案中RNA模板需要量少，适用于任何来源生物样品RNA，具有经济性好、效率高、可靠性强、冗余度低及假阳性低等优点。
图1是本发明实施例提供的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明公开一种基于mRNA水平的3’ -cDNA限制性片段展示方法，其特点是经济性好、冗余度低及假阳性低。该方法的主要步骤包括(I)以总RNA(或者mRNA)为模板，以设计合成的Oligo (dT)18V引物通过反转录合成cDNA双链。(2)将步骤(I)得到产物通过Taq I内切酶进行酶切。(3)将步骤(2)产物与设计合成的“Y”形接头用T4连接酶连接。
(4)以Oligo (dT)18V及Taq I“Y”形接头序列设计引物进行PCR扩增。(5)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(原理见图1)。本发明方法能够展示基于mRNA水平的基因表达谱，可用来筛选差异表达基因。方案中RNA模板需要量少，适用于任何来源生物样品RNA，具有经济性好、冗余度低及假阳性低等优点。
所述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测进一步包括(I)以总RNA或者mRNA为模板，以设计合成的Oligo (dT) 18V引物通过反转录合成cDNA双链；(2)将步骤(I)得到产物通过Taq I内切酶进行酶切，得到两端具有粘性末端的cDNA片段及一端为粘性末端另一端为PolyA末端的cDNA片段；(3)将步骤⑵产物与设计合成的“Y”形接头用T4连接酶连接，得到两种产物，一种是两端都连接上“Y”形接头的片段，另一种是一端连接上“Y”形接头一端具有PolyA末端的cDNA片段；(4)以Oligo (dT)18V及Taq I“Y”形接头序列设计引物进行PCR扩增，其结果是两端都连接上“Y”形接头的片段在PCR扩增中因其片段两尾的互补序列而形成锅柄状结构，扩增受到抑制；而一端连接上“Y”形接头一端具有PolyA末端的cDNA片段在扩增中得 到正常指数扩增。进一步，所述展示方法应用“Y”形接头与酶切片段连接，抑制非PolyA末端的cDNA扩增，让具有“Y”形接头及PolyA末端的cDNA得到指数扩增，排除了非PolyA末端cDNA的干扰，从而只扩增cDNA 3’末端序列。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种3’ -CDNA展示方法，其特征在于，该方法的主要步骤包括 (1)以总RNA或者mRNA为模板，以设计合成的Oligo(dT) 18V引物通过反转录合成cDNA双链； (2)将步骤(I)得到产物通过TaqI内切酶进行酶切； (3)将步骤(2)产物与设计合成的“Y”形接头用T4连接酶连接； (4)以Oligo(dT)18V及Taq I “Y”形接头序列设计引物进行PCR扩增； (5)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2.如权利要求1所述的3’-cDNA展示方法，其特征在于，所述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法进一步包括 (1)以总RNA或者mRNA为模板，以设计合成的Oligo(dT) 18V引物通过反转录合成cDNA双链； (2)将步骤(I)得到产物通过TaqI内切酶进行酶切，得到两端具有粘性末端的cDNA片段及一端为粘性末端另一端为PolyA末端的cDNA片段； (3)将步骤(2)产物与设计合成的“Y”形接头用T4连接酶连接，得到两种产物，一种是两端都连接上“Y”形接头的片段，另一种是一端连接上“Y”形接头一端具有PolyA末端的cDNA片段； (4)以Oligo(dT)18V及Taq I “Y”形接头序列设计引物进行PCR扩增，其结果是两端都连接上“Y”形接头的片段在PCR扩增中因其片段两尾的互补序列而形成锅柄状结构，扩增受到抑制；而一端连接上“Y”形接头一端具有PolyA末端的cDNA片段在扩增中得到正常指数扩增。
3.如权利要求1所述的3’-cDNA展示方法，其特征在于，所述展示方法应用“Y”形接头与酶切片段连接，抑制非PolyA末端的cDNA扩增，让具有“Y”形接头及PolyA末端的cDNA得到指数扩增，排除了非PolyA末端cDNA的干扰，从而只扩增cDNA 3’末端序列。
全文摘要
本发明公开了一种3’-cDNA展示方法，步骤为(1)以总RNA(或者mRNA)为模板，以设计合成的Oligo (dT)18V引物通过反转录合成cDNA双链；(2)将步骤(1)得到产物通过TaqⅠ内切酶进行酶切；(3)将步骤(2)产物与设计合成的“Y”形接头用T4连接酶连接；(4)以Oligo (dT)18V及TaqⅠ“Y”形接头序列设计引物进行PCR扩增。(5)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明应用“Y”形接头与酶切片段连接，抑制非PolyA末端的cDNA扩增，让具有“Y”形接头及PolyA末端的cDNA得到指数扩增，排除了非PolyA末端cDNA的干扰，从而只扩增cDNA 3’末端序列，具有经济性好、效率高、可靠性强、冗余度低及假阳性低等优点，能够同时研究多个样本多个时期的生物体mRNA时空特异表达情况，是发掘基因的功能、探索生物发育机制等的有力工具。
文档编号C12Q1/68GK102994632SQ201210382040
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者贾定洪, 郑林用, 彭卫红, 甘炳成, 黄忠乾, 谭伟, 王波, 谢丽源 申请人:四川省农业科学院土壤肥料研究所