专利名称：一种菊酯类农药降解酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及农药降解酶的制备方法技术领域，尤其涉及一种菊酯类农药降解酶的制备方法。
背景技术：
菊酯类农药是广谱性杀虫剂，具有速效、高效、低毒、低残留的特点，对140多种害虫的防治有特效。然而，用农药对农作物进行害虫防治时将使农作物的表面或多或少残留一些农药，尤其是菊酯类农药降解速度慢，不仅对人体健康造成危害，而且对生态系统也造成一定的影响。为此，人们采用微生物对农药进行降解，而微生物对农药的作用方式多样，多数属于通过酶促反应降解农药。
中山大学的刘玉焕等通过(一种新型酯酶及其应用，ZL201010547206. 8)中的高通量功能筛选的方法克隆了Sp.ZD112中具有菊酯类农药降解能力的新基因est825，构建了重组表达的大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)/pET-28a_est825，酶学性质研究发现，通过此重组大肠杆菌生产的重组酶在常温下对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分别达到80. 82%, 82. 98%, 69. 23%和69. 65%，菊酯类农药降解酶降解效率高、安全无毒、环境适应强，具有良好的应用前景。目前，国内外已出现通过构建基因组文库克隆一个菊酯类农药降解酶的新基因，并构建能高效表达该基因的工程菌等相关研究，如山东农业大学的闻艳春等(一种工程菌的高酶活及其固定化细胞对农药的降解，中国环境科学，1999，19(5))将抗性尖音库蚊五带亚种的抗有机磷农药基因克隆到质粒pRL-439中，获得高酶活工程菌，表达的酶对两类难降解农药(有机氯、菊酯类)可降解90%以上，但未提及产酶量；中国科学院动物研究所的乔传令等(一种超级工程菌及其表达的解毒酶和其构建方法及应用，ZL200410042712. 6)分别克隆解毒酯酶和水解酶基因，将此基因分别克隆到表达载体PETDuet-I上，构建融合表达载体pETDuet-bl-opd，最后转化得到重组菌株并进行诱导培养，该超级工程菌和解毒酶可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药，但未提及降解率及产酶量；Heidari Rama等(Hydrolysis of pyrethroids bycarboxylesterases from Lucilia cuprina and Drosophila melanogaster with activesites modified by in vitro mutagenesis, Insect Biochemistry and MolecularBiology, 2職，35(6) :597飞09)通过基因突变技术改变来源于绿蝇与家蝇的羧酸酯酶的活性位点，使得该酶对顺、反式菊酯类农药的降解能力比野生的提高很多倍，而且突变位点不同，也会影响其对顺、反式菊酯类农药的降解能力。Stok Jeanette E等(Identification,expression, and purification of a pyrethroid-hydrolyzing carboxylesterase frommouse liver microsomes, Journal of Biological Chemistry, 279 (28):29863 29869)从小鼠肝微粒中克隆了 I个能降解菊酯类农药的羧酸酯酶基因，并在杆状病毒中表达、纯化，还研究该酶对顺、反式菊酯类农药的催化常数，又从小鼠的肝微粒CDNA文库中筛选分离第2个水解菊酯类农药的羧酸酯酶基因。
然而，目前国内外暂缺有关采用基因工程菌高密度发酵技术高效生产菊酯类农药降解酶的技术，因此本领域迫切需要开发高产菊酯类农药降解酶的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种菊酯类农药降解酶的制备方法，该制备方法利用重组大肠杆菌高效生产菊酯类农药降解酶。本发明是通过以下技术来实现的。
一种菊酯类农药降解酶的制备方法，包括以下步骤
O以重组大肠杆菌{E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在_86°C的温度下保存；
2)种子培养将甘油管中的生产菌种按2 4%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为20(T220r/min、温度为37°C、培养时间为8 IOh的培养条件在恒温摇床中培养；在重组大肠杆菌的发酵过程中，质粒稳定性对产物表达非常重要，在较高的温度如37°C下，重组大肠杆菌的质粒稳定性较高。3)发酵培养将培养好的种子液以2 5%的接种量接入装有3. 75^4. 5L发酵培养基的7. 5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为24 28h，在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在20% 25% ;本发明的发酵规模不限于7. 5L，可根据实际需要适当扩大发酵规模。4)补料发酵培养发酵培养4 6h后，流加甘油和酵母粉的混合补料液，控制菌体的比生长速率为O. Γθ. 21Γ1，补料发酵培养阶段持续的时间为l(Tl4h ;混合补料液通过流加的方式补充，补料速率以能够维持菌体生长的及表达菊酯类农药降解酶所需、且以维持发酵系统中较稳定的溶氧和PH值为依据设定，保证重组大肠杆菌的发酵营养源。5)乳糖诱导补料发酵培养至菌体的OD6tltol值达到10(Γ140时，一次性添加乳糖溶液，使发酵液乳糖的浓度为5lg/L，将温度降至3(T35°C开始诱导，诱导过程中继续流加步骤4)中的混合补料液，维持发酵液中甘油的浓度为f2g/L，乳糖诱导的时间持续8 10h ；采用乳糖诱导具有成本低、环保、对人体无害的优点。6)酶粉制备发酵结束后，在4 8°C的温度下离心收集菌体，将菌体用pH6. 5^7. O的磷酸盐缓冲液配制成质量浓度15°/Γ20%的菌悬液，将菌悬液在4°C的温度下、150Mpa的压力下高压破碎得到破碎液，将破碎液在4°C的温度下进行高速离心制得上清液，或用低温微膜过滤制得过滤液，再将上清液或过滤液真空冷冻干燥即制得酶粉。其中，所述步骤2)中，所述摇瓶种子培养基的pH为7. 0，所述摇瓶种子培养基包括以下组分胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素5(Tl00mg/L。其中，所述步骤3)中，所述发酵培养基的pH为6. 8，所述发酵培养基包括以下组分甘油 5 8g/L，蛋白胨 3 10g/L，酵母粉 3 8g/L，(NH4)2SO4 5 10g/L，MgSO4·7Η20 I 3g/L, KH2PO4 3. 4 6. 85g/L, K2HPO4.12H20 5. 68 11. 35g/L,微量元素液 I 2mL/L，卡那霉素5(Tl00mg/L。本发明采用甘油、蛋白胨和酵母粉等原料进行生产，适于大规模生产。其中，所述微量元素液包括以下组分=CaCl2 2. 0g/L, ZnSO4-7H20 5. 0g/L,MnS04.H20 0. 5g/L, Na2-EDTA 18. Og/L, FeSO4*7H20 10. 0g/L，CuS04.5H20 2. 5g/L，CoC12.6H200. 2g/L, (NH4) 6Mo7024 ·4Η20 0. lg/L。
其中，所述微量元素液为经溶于无菌水中，再用0.22 μ m的滤膜过滤除菌后的微
量元素液。其中，所述步骤3)具体为发酵培养将培养好的种子液以2 5%的接种量接入装有3. 75^4. 5L发酵培养基的7. 5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为24 28h，并在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在209Γ25%，通气量为O. 5 4vvm，搅拌转速20(Tl000r/min，培养温度37°C，流加20% 25%的氨水和3mol/L的盐酸溶液控制发酵液的PH为6. 8^7. O。其中，所述步骤4)中，所述甘油和酵母粉的混合补料液包括以下组分甘油30(T500g/L，酵母粉 6(Tl00g/L，卡那霉素 5(Tl00mg/L。其中，甘油含量的测定方法
采用 HPLC (高效液相色谱法)Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m)色谱柱,柱温37°C，进样量10μ 1，流动相纯水，流速1.0mL/min。在补料发酵阶段每小时检测一次发酵液甘油浓度，监控甘油残余量；在乳糖诱导阶段同样每小时检测甘油浓度，通过控制补料速率控制甘油残量在f 2g/L。其中，菌体浓度的测定方法
采用分光光度法在600nm波长下检测发酵液的光吸收值，根据菌体浓度确定诱导起始点。其中，菊酯类农药降解酶的酶活力的测定方法
以对硝基苯酚乙酸酯(pNPA)为底物，采用分光光度法测定，酶活定义为在pH6. 5、温度40°C时每分钟催化水解pNPA生成I μ mo I对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活单位(U)。具体测定方法如下
(1)底物母液配制称取18.Img pNPA溶解于ImL甲醇中，即配成O. IM的底物母液,并将底物母液在4°C储存备用；
(2)测定液配制取底物母液O.4mL,缓慢加入到9. 6mL pH6. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，并充分混匀，即配制好测定液；
(3)酶活测定取5μ I酶液加入200 μ I的测定液中，使酶液和测定液在40°C的温度下反应4min制得反应液，同时以灭活酶液做空白对照,将反应液稀释至一定倍数后取300 μ I加入酶标板，在405nm波长处测定吸光值，根据对硝基苯酚的浓度与405nm下的吸光值所做的标准曲线，得出酶促反应所生成对硝基苯酚的量，进而计算出酶活力。本发明的有益效果为本发明利用重组大肠杆菌高密度发酵技术，采用大肠杆菌\E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}高效表达菊酯类农药降解酶，发酵过程中采用乳糖对发酵液进行诱导，具有成本低、环保、对人体无害的优点，在发酵结束后，发酵液OD6tltol值达125 165，发酵液降解酶酶活为200(T3000U/mL，最终制得的降解酶酶粉产量25 40g/L，酶粉酶活为4800(T60000U/g，大大提高了菊酯类农药降解酶的产量，降低菊酯类农药降解酶的使用成本，为规模化生产菊酯类农药降解酶提供了一条有效、经济、可行的途径。
图I为本发明的实施例一的发酵过程曲线图。图2为本发明的实施例二的发酵过程曲线图。
图3为本发明的实施例三的发酵过程曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例一。本实施例的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，包括以下步骤
O以重组大肠杆菌{E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在_86°C的温度下保存。2)种子培养将甘油管中的生产菌种按2%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为220r/min、温度为37°C、培养时间为9h的培养条件在恒温摇床中培养；所述摇瓶种子培养基的PH为7. 0，所述摇瓶种子培养基包括以下组分胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L,卡那霉素 50mg/L。3)发酵培养将培养好的种子液以4%的接种量接入装有4L发酵培养基的7. 5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为26h，在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌 转速来控制发酵液溶氧值维持在20%，通气量为O. 5^4vvm,搅拌转速20(Tl000r/min，培养温度37°C，流加25%的氨水和3mol/L的盐酸溶液控制发酵液的pH为6. 8 ;
本实施例中，所述发酵培养基的PH为6. 8，所述发酵培养基包括以下组分甘油5g/L，蛋白胨 5g/L，酵母粉 3g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4.7H20 2. 5g/L，KH2PO4 6. 85g/L，K2HPO4* 12H20 11. 35g/L，微量元素液 I. 5mL/L，卡那霉素 50mg/L ；
本实施例中，所述微量元素液包括以下组分CaCl2 2. Og/L, ZnSO4-7H20 5. Og/L,MnS04.H20 0. 5g/L, Na2-EDTA 18. Og/L, FeSO4*7H20 10. 0g/L，CuS04.5H20 2. 5g/L，CoC12.6H200. 2g/L，(NH4) 6Μο7024 ·4Η20 0. lg/L ；
本实施例中，所述微量元素液为经溶于无菌水中，再用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌后的微量元素液。4)补料发酵培养发酵培养4h后，流加甘油和酵母粉的混合补料液，控制菌体的比生长速率为0. Γθ. 21Γ1，补料发酵培养阶段持续的时间为12h ;所述甘油和酵母粉的混合补料液包括以下组分甘油500g/L，酵母粉100g/L，卡那霉素50mg/L ；
5)乳糖诱导补料发酵培养至菌体的OD6tltol值达到120时，一次性添加乳糖溶液，使发酵液乳糖的浓度为5g/L，将温度降至33°C开始诱导，诱导过程中继续流加步骤4)中的混合补料液，维持发酵液中甘油的浓度为l 2g/L，乳糖诱导的时间持续10h。6)酶粉制备发酵结束后，在4°C的温度下离心收集菌体，将菌体用pH6. 8的磷酸盐缓冲液配制成质量浓度15%的菌悬液，将菌悬液在4°C的温度下、150Mpa的压力下高压破碎得到破碎液，将破碎液在4°C的温度下进行高速离心制得上清液，或用低温微膜过滤制得过滤液，再将上清液或过滤液真空冷冻干燥即制得酶粉。本实施例中，发酵结束后，发酵液OD6tltlnm值达165，发酵液降解酶酶活为3000U/mL，最终制得的降解酶酶粉产量40g/L，酶粉酶活为60000U/g。发酵过程曲线见图I。实施例二。本实施例的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，包括以下步骤
O以重组大肠杆菌{E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在_86°C的温度下保存。2)种子培养将甘油管中的生产菌种按2%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为200r/min、温度为37°C、培养时间为IOh的培养条件在恒温摇床中培养；所述摇瓶种子培养基的PH为7. 0，所述摇瓶种子培养基包括以下组分胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L,卡那霉素 50mg/L。3)发酵培养将培养好的种子液以2%的接种量接入装有3. 75L发酵培养基的7. 5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为28h，并在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在20%,通气量为O. 5^4vvm,搅拌转速20(Tl000r/min，培养温度37°C，流加25%的氨水和3mol/L的盐酸溶液控制发酵液的pH为
6.9 ；
本实施例中，所述发酵培养基的PH为6. 8，所述发酵培养基包括以下组分甘油8g/L， 蛋白胨 5g/L，酵母粉 5g/L，(NH4)2SO4 8g/L，MgSO4.7H20 lg/L, KH2PO4 4. 57g/L, K2HPO4* 12H20
7.57g/L，微量元素液lmL/L，卡那霉素50mg/L ；
本实施例中，所述微量元素液包括以下组分CaCl2 2. Og/L, ZnSO4-7H20 5. Og/L,MnS04.H20 0. 5g/L, Na2-EDTA 18. Og/L, FeSO4*7H20 10. 0g/L，CuS04.5H20 2. 5g/L，CoC12.6H200. 2g/L，(NH4) 6Μο7024 ·4Η20 0. lg/L ；
本实施例中，所述微量元素液为经溶于无菌水中，再用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌后的微量元素液。4)补料发酵培养发酵培养6h后，流加甘油和酵母粉的混合补料液，控制菌体的比生长速率为0. Γθ. 21Γ1，补料发酵培养阶段持续的时间为12h ;所述甘油和酵母粉的混合补料液包括以下组分甘油400g/L,酵母粉80g/L,卡那霉素50mg/L ；
5)乳糖诱导补料发酵培养至菌体的OD6tltol值达到140时，一次性添加乳糖溶液，使发酵液乳糖的浓度为6g/L，将温度降至30°C开始诱导，诱导过程中继续流加步骤4)中的混合补料液，维持发酵液中甘油的浓度为l 2g/L，乳糖诱导的时间持续10h。6)酶粉制备发酵结束后，在4°C的温度下离心收集菌体，将菌体用pH6. 5的磷酸盐缓冲液配制成质量浓度18%的菌悬液，将菌悬液在4°C的温度下、150Mpa的压力下高压破碎得到破碎液，将破碎液在4°C的温度下进行高速离心制得上清液，或用低温微膜过滤制得过滤液，再将上清液或过滤液真空冷冻干燥即制得酶粉。本实施例中，发酵结束后，发酵液OD6tltlnm值达150，发酵液降解酶酶活为2600U/mL，最终制得的降解酶酶粉产量33g/L，酶粉酶活为52000U/g。发酵过程曲线见图2。实施例三。本实施例的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，包括以下步骤
O以重组大肠杆菌{E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在_86°C的温度下保存。2)种子培养将甘油管中的生产菌种按4%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为220r/min、温度为37°C、培养时间为8h的培养条件在恒温摇床中培养；所述摇瓶种子培养基的PH为7. 0，所述摇瓶种子培养基包括以下组分胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L,卡那霉素 100mg/L。3)发酵培养将培养好的种子液以2%的接种量接入装有3. 75L发酵培养基的7.5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为25h，在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在20%，通气量为O. 5 4VVm，搅拌转速20(Tl000r/min，培养温度37°C，流加25%的氨水和3mol/L的盐酸溶液控制发酵液的pH为7. O ;
本实施例中，所述发酵培养基的PH为6. 8，所述发酵培养基包括以下组分甘油6g/L，蛋白胨 10g/L，酵母粉8g/L，(MM)2SO4 10g/L,MgS04*7H20 3g/L,KH2PO4 3. 4g/L,K2HPO4*12H205. 68g/L，微量元素液2mL/L，卡那霉素lOOmg/L ；
本实施例中，所述微量元素液包括以下组分CaCl2 2. Og/L, ZnSO4-7H20 5. Og/L,MnS04.H20 0. 5g/L, Na2-EDTA 18. Og/L, FeSO4*7H20 10. 0g/L，CuS04.5H20 2. 5g/L，CoC12.6H200. 2g/L，(NH4) 6Μο7024 ·4Η20 0. lg/L ；
本实施例中，所述微量元素液为经溶于无菌水中，再用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌后的微量元素液。
4)补料发酵培养发酵培养5h后，流加甘油和酵母粉的混合补料液，控制菌体的比生长速率为0. Γθ. 21Γ1，补料发酵培养阶段持续的时间为IOh ;所述甘油和酵母粉的混合补料液包括以下组分甘油300g/L，酵母粉60g/L，卡那霉素100mg/L ；
5)乳糖诱导补料发酵培养至菌体的OD6tltol值达到100时，一次性添加乳糖溶液，使发酵液乳糖的浓度为8g/L，将温度降至35°C开始诱导，诱导过程中继续流加步骤4)中的混合补料液，维持发酵液中甘油的浓度为l 2g/L，乳糖诱导的时间持续10h。6)酶粉制备发酵结束后，在4°C的温度下离心收集菌体，将菌体用pH6. 5的磷酸盐缓冲液配制成质量浓度20%的菌悬液，将菌悬液在4°C的温度下、150Mpa的压力下高压破碎得到破碎液，将破碎液在4°C的温度下进行高速离心制得上清液，或用低温微膜过滤制得过滤液，再将上清液或过滤液真空冷冻干燥即制得酶粉。本实施例中，发酵结束后，发酵液OD6tltlnm值达125，发酵液降解酶酶活为2000U/mL，最终制得的降解酶酶粉产量25g/L，酶粉酶活为48000U/g。发酵过程曲线见图3。本发明的实施例一至实施例三中，甘油含量的测定方法
采用 HPLC (高效液相色谱法)Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m)色谱柱,柱温37°C，进样量10μ 1，流动相纯水，流速1.0mL/min。在补料发酵阶段每小时检测一次发酵液甘油浓度，监控甘油残余量；在乳糖诱导阶段同样每小时检测甘油浓度，通过控制补料速率控制甘油残量在f 2g/L。菌体浓度的测定方法
采用分光光度法在600nm波长下检测发酵液的光吸收值，根据菌体浓度确定诱导起始点。菊酯类农药降解酶的酶活力的测定方法
以对硝基苯酚乙酸酯(pNPA)为底物，采用分光光度法测定，酶活定义为在pH6. 5、温度40°C时每分钟催化水解pNPA生成I μ mo I对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活单位(U)。具体测定方法如下
(1)底物母液配制称取18.Img pNPA溶解于ImL甲醇中，即配成0. IM的底物母液,并将底物母液在4°C储存备用；
(2)测定液配制取底物母液0.4mL,缓慢加入到9. 6mL pH6. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，并充分混匀，即配制好测定液；(3)酶活测定取5 μ I酶液加入200 μ I的测定液中，使酶液和测定液在40°C的温度下反应4min制得反应液，同时以灭活酶液做空白对照,将反应液稀释至一定倍数后取300 μ I加入酶标板，在405nm波长处测定吸光值，根据对硝基苯酚的浓度与405nm下的吸光值所做的标准曲线，得出酶促反应所生成对硝基苯酚的量，进而计算出酶活力。 以上所述实施方式，只是本发明的较佳实施方式，并非来限制本发明实施范围，故 凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括本发明专利申请范围内。
权利要求
1.一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1)以重组大肠杆菌{E.coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在_86°C的温度下保存； 2)种子培养将甘油管中的生产菌种按2 4%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为20(T220r/min、温度为37°C、培养时间为8 IOh的培养条件在恒温摇床中培养； 3)发酵培养将培养好的种子液以2 5%的接种量接入装有3. 75^4. 5L发酵培养基的7. 5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为24 28h，在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在20% 25% ； 4)补料发酵培养发酵培养4 6h后，流加甘油和酵母粉的混合补料液，控制菌体的比生长速率为O. Γθ. 21Γ1，补料发酵培养阶段持续的时间为l(Tl4h ； 5)乳糖诱导补料发酵培养至菌体的OD6tltol值达到10(Γ140时，一次性添加乳糖溶液，使发酵液乳糖的浓度为5lg/L，将温度降至3(T35°C开始诱导，诱导过程中继续流加步骤4)中的混合补料液，维持发酵液中甘油的浓度为l 2g/L，乳糖诱导的时间持续8 IOh ； 6)酶粉制备发酵结束后，在4 8°C的温度下离心收集菌体，将菌体用pH6.5^7. O的磷酸盐缓冲液配制成质量浓度15°/Γ20%的菌悬液，将菌悬液在4°C的温度下、150Mpa的压力下高压破碎得到破碎液，将破碎液在4°C的温度下进行高速离心制得上清液，或用低温微膜过滤制得过滤液，再将上清液或过滤液真空冷冻干燥即制得酶粉。
2.根据权利要求I所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于所述步骤2)中，所述摇瓶种子培养基的pH为7.0，所述摇瓶种子培养基包括以下组分胰蛋白胨IOg/L,酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L,卡那霉素 5(Tl00mg/L。
3.根据权利要求I所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于所述步骤3)中，所述发酵培养基的pH为6. 8，所述发酵培养基包括以下组分甘油5lg/L，蛋白胨TlOg/L，酵母粉 3 8g/L，(NH4)2SO4 5 10g/L，MgS04.7H20 I 3g/L，KH2PO4 3· 4 6. 85g/L，K2HPO4* 12H20 5. 68 IL 35g/L，微量元素液 I 2mL/L，卡那霉素 5(Tl00mg/L。
4.根据权利要求3所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于所述微量元素液包括以下组分CaCl2 2. Og/L, ZnSO4*7H20 5. 0g/L, MnS04*H20 (λ 5g/L，Na2-EDTA18. Og/L, FeS04*7H20 10. Og/L, CuSO4·5Η20 2. 5g/L, CoC12*6H20 0. 2g/L, (NH4)6Μο7024 ·4Η200.lg/Lo
5.根据权利要求4所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于所述微量元素液为经溶于无菌水中，再用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌后的微量元素液。
6.根据权利要求I所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于所述步骤3)具体为发酵培养将培养好的种子液以2 5%的接种量接入装有3.75^4. 5L发酵培养基的7. 5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为24 28h，并在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在20% 25%,通气量为0. 5^4vvm,搅拌转速20(Tl000r/min，培养温度37°C，流加20% 25%的氨水和3mol/L的盐酸溶液控制发酵液的pH 为 6. 8 7. O。
7.根据权利要求I所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于所述步骤4)中，所述甘油和酵母粉的混合补料液包括以下组分甘油30(T500g/L，酵母粉6(Tl00g/L，卡那霉素 5(Tl00mg/L。
全文摘要
本发明涉及农药降解酶的制备方法技术领域，尤其涉及一种菊酯类农药降解酶的制备方法，包括以下步骤1)以重组大肠杆菌{E.coliBL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在-86℃的温度下保存；2)种子培养；3)发酵培养；4)补料发酵培养；5)乳糖诱导；6)酶粉制备。本发明采用重组大肠杆菌高效表达菊酯类农药降解酶，最终制得的降解酶酶粉产量25~40g/L，酶粉酶活为48000~60000U/g，大大提高了菊酯类农药降解酶的产量，降低菊酯类农药降解酶的使用成本，为规模化生产菊酯类农药降解酶提供了一条有效、经济、可行的途径。
文档编号C12R1/19GK102876642SQ20121041221
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者黄皓, 罗华建, 刘玉焕, 梁卫驱, 胡珊, 刘远星, 罗诗, 莫忠兴, 李艳芳, 陈仕丽, 徐匆 申请人:东莞市农业科学研究中心, 中山大学