专利名称：一种制备苹果树腐烂病菌转化子及gfp标记菌株的方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种苹果树腐烂病菌转化子及其制备方法，同时还提供一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株及其制备方法。
背景技术：
黑腐皮壳菌(Valsa ceratosperma)引起的苹果树腐烂病,是对苹果产业威胁最大的一种毁灭性病害，该病在我国苹果产区发生普遍，可造成果树主干及整树死亡，甚至毁园(陈策，1987 ;2009)。自1916年苹果树腐烂病在辽宁省南部地区发现以来，该病已在我国有过几次大流行，造成了严重的产量和经济损失(陈策等，1980 ;2009)。随着我国苹果种植结构和栽培制度的调整，腐烂病已成为限制我国苹果产业发展的主要因子。2008年，国家苹果产业技术体系调查显示，全国范围内苹果树腐烂病的总体发生率为52. 7%，部分地区发病率高达85%以上(曹克强等，2009)。2011年，山东烟台苹果产区腐烂病再次严重发生，本课题 组调查发现，旺盛结果期的苹果树具有新病疤的病株率为68. 20%，死株率为2. 76% (王彩霞等，2012)。针对苹果树腐烂病造成的严重危害及防治困难等问题，引起了国内外相关科研工作者及多国政府部门的高度重视，该病现在仍被列为欧洲的主要检疫对象(http//WWW.eppo. orR)。我国自上世纪50年代以来,对苹果树腐烂病的发生和流行规律、防治技术及病原学等进行了系统研究，取得了许多有意义的成果。目前生产上对于腐烂病的防控，采取的措施主要包括加强栽培管理、喷药保护、及时刮治病斑等，但这些措施都未能有效控制病害的发生和流行。其中一个重要原因是对于腐烂病菌的侵染、致病过程与致病机理尚不清楚，制约了对病害发生、流行规律的深入了解，导致病害防治工作低效、盲目和被动，造成腐烂病的危害近年来仍在逐年加重。植物病原菌侵染致病过程的研究，对于病害防控具有重要的实践价值，可以为施药提供一定的科学依据，如施药时期、施药部位、施药次数等，还可根据抗感病品种不同的侵染过程而筛选抗病品种。对于真菌侵染过程的研究，多采用切片染色结合电子显微镜观察的方法进行，但对于木本植物的枝干类病害如苹果树腐烂病、枝干轮纹病等，由于材料木质化程度高，采用传统的技术方法很难取得理想的观察效果，这也是该类病害侵染致病过程研究无法取得突破性进展的主要原因之一。随着生物技术和分子生物学的不断发展，利用分子标记如绿色荧光蛋白(GFP)研究病原菌的侵染过程与致病机理已成为可能(Spellig et al.，1996)。因此，在目前缺乏有效抗腐烂病品种及杀菌剂的前提下，利用GPF标记菌株揭示腐烂病菌的侵染致病过程及其潜伏位点，明确其致病机理及其与寄主的互作机制，将为苹果树腐烂病的有效、安全控制提供新的指导思路，为生产上科学、高效地防控腐烂病提供坚实的理论基础。绿色突光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作为一种重要的报告基因，在病原菌的侵染致病过程、病原菌在寄主组织中的发育和形态观察、致病机理及其病原物-寄主互作研究等诸多方面均显示了良好的应用前景(Chen et al. , 2003;Dueketal. , 2004;Sarrocco et al. , 2007;Rajasekaran et al. , 2008;Mansouri et al.,2009;Pliego et al.，2009)。在植物病原真菌中，GFP标记技术也已得到广泛应用，并取得了前所未有的成果，受到植物病理学家的高度关注。对于苹果树腐烂病菌而言，由于其功能基因尚未被克隆，因此，要得到其GFP标记菌株，首先必须建立高效、稳定的腐烂病菌遗传转化技术体系。
目前广泛采用的真菌转化方法有聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化法、电激法、醋酸锂法、限制性内切酶介导法(REMI)和基因枪转化法等，这些方法大都需以原生质体为受体。高静等(2011)报道了 PEG介导的苹果树腐烂病菌原生质体遗传转化法，转化效率为44个/μ g DNA，作者仅得到218个转化子。有大量报道称原生质体制备繁琐，或不同批次的酶活性不一致，导致原生质体制备试验不能很好的重复(Weld et al. , 2006; Levyet et al. , 2008;Bashi Zafer Dallal et al.，2010),是使用原生质体作为转化受体的主要问题。因此原生质体作为转化受体，仍有问题需要解决。针对这一问题，许多学者提出了一些改进技术和新方法，其中最有效的是根癌农杆菌介导的真菌遗传转化法(Agrobacteriumt umefaciens-mediated transformation, ATMT),在多种丝状真菌的遗传转化中得到成功应用，高静(2011，硕士论文)初步建立了苹果树腐烂病菌的ATMT转化体系，但是转化效率极低，每IO6个分生孢子仅得到6个转化子。
总之，目前缺乏高效、稳定的苹果树腐烂病菌遗传转化技术体系，更没有关于腐烂病菌GFP标记方法的报道，成为腐烂病菌侵染致病过程与机理研究的瓶颈。因此，建立新的高效的苹果树腐烂病菌遗传转化体系，获得稳定表达绿色荧光蛋白的标记菌株，对于推动腐烂病菌侵染致病过程的组织学研究及其分子生物学研究具有重大意义。发明内容
本发明的目的在于提供一种制备苹果树腐烂病菌转化子的方法及制 备GFP标记腐烂病菌的方法。本发明一个方面提供一种制备苹果树腐烂病菌转化子的方法，包括以下步骤
A.制备平果树腐烂病囷分生抱子
( U将苹果树腐烂病菌接种于PDA培养基上，活化培养3天；
(2)将活化培养的腐烂病菌打取菌饼接种于含有大麦粒的PDA培养基上，恒温培养20-30天，至橘黄色分生孢子角溢出；
B.培养农杆菌
(I)将质粒pBIG3C (由中国农业大学彭友良教授馈赠)转入农杆菌中；
(2)取步骤B(I)中的农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB液体培养基中，28°C震荡培养I天；
(3)取步骤B (2)中的农杆菌菌液于含卡那霉素的基本培养基中，28°C震荡培养2 天，测量菌液的OD6c 值；
(4)用含有乙酰丁香酮和2- (N-吗啉基)乙磺酸钠的頂培养基稀释步骤B (3) 中的农杆菌悬浮液至0D_值为O. 15，继续在28°C条件下振荡培养6h备用；
C.根癌农杆菌与苹果树腐烂病菌分生孢子共培养
(I)取步骤A (2)中的苹果树腐烂病菌分生孢子角至步骤B (4)中的农杆菌悬浮液中，用农杆菌溶液稀释混合均匀，调节浓度至IO6个分生孢子/mL ；(2)将步骤C (I)中的农杆菌-腐烂病菌分生孢子混合液，按200 μ L/皿的量均匀涂布于铺有玻璃纸的含有乙酰丁香酮和2- (N-吗啉基)乙磺酸钠的Co-M培养基上，置于25°C共培养3 5天；D.转化子的筛选及保存(I)将步骤C (2)中的玻璃纸放于一空的无菌培养皿中，使有菌丝的一面朝上，玻璃纸上面覆盖含有潮霉素和头孢霉素PDA培养基，置于25°C恒温箱中培养3飞天；(2)将长出的腐烂病菌菌落转移至含有潮霉素的PDA平板中继续培养，将能继续生长的菌落再次接种至含有潮霉素的PDA平板上，连续培养三代得到苹果树腐烂病菌转化子;·
(3)将得到的转化子保存在含有50 μ g/mL潮霉素的PDA斜面培养基上，置于4°C冰箱中保存。根据本发明的具体示例，步骤A中培养的温度均为25V。根据本发明的具体示例，步骤A中PDA培养基制作方法如下200g去皮马铃薯，加适量水蒸煮30min后用四层纱布过滤，然后在滤液中加入葡萄糖20g、15g琼脂煮沸溶解，补充蒸馏水至IOOOmL,置于121°C灭菌30min。根据本发明的具体示例，步骤B中采用电击的方法将质粒pBIG3C转入农杆菌中。根据本发明的具体示例，步骤B中LB液体培养基为2mL含有50 μ g/mL卡那霉素、50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL链霉素的的LB液体培养基。根据本发明的具体示例，步骤B中LB液体培养基配方如下蛋白胨10g，酵母粉5g, NaCl 5g,补充去离子水至IOOOmL, pH7. O,分装后置于121 °C高压灭菌30min。根据本发明的具体示例，步骤B中农杆菌菌液与基本培养基的体积为O. 25:50。根据本发明的具体示例，步骤B中为含50 μ g/mL的卡那霉素的50mL基本培养基。根据本发明的具体示例，步骤B中基本培养基(MM)配方如下磷酸氢钾缓冲液(K-buffer)，含K2HP04200g/L，KH2P04145g/L,用 H3PO4 调 ρΗ7· O,使用量为IOmL ；硫酸镁-氯化钠溶液(M-Nbuffer)，含 MgSO4 · 7H20 30g/L 和 NaC115g/L，使用量为 20mL ；20%葡萄糖(w/v),20g葡萄糖溶解于70g去离子水中，定容至IOOmL,过滤除菌,使用量为IOmL ；其他成分包括l%CaCl2 · 2H20 (w/v) ImL, 20%NH4N03 (w/v) 2. 5mL，使用之前加入0. 01%FeS04 (w/v) IOmL,补充去离子水至 lOOOmL，以 H3PO4 或 NaOH 调节 pH 至 7. O。根据本发明的具体示例，步骤B中为含有200 μ M的乙酰丁香酮和1. 0mg/mL的
2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的頂培养基。根据本发明的具体示例，步骤B中诱导培养基培养基(IM)配方如下磷酸氢钾缓冲液pH4. 9 (1. 25Μ K-buffer, ρΗ4· 9)，含 K2HP04184g/L，KH2P04145g/L,用H3p04调节pH，使用量为0. 8mL ；其他成分为M-N溶液 20mL, l%CaCl2 · 2H20 (w/v) ImL, 20% 葡萄糖(w/v) IOmL,20%NH4N03 (w/v) 2. 5mL, 50% 甘油(v/v) IOmL,使用前加入 0. 01%FeS04 (w/v) IOmL,补充去离子水至 1000mL。
乙酰丁香酮(AS)配制取AS O. 1962g，用二甲基亚砜(DMSO)直接溶解后定容到 10mL，即为O.1M的AS，分装于无菌1. 5ml离心管中，置于_20°C保存备用。
2- (N-吗啉基)乙磺酸钠(MES)的配制在无菌1. 5mL离心管中称取O.1 O. 15g MES，用1. (Tl. 5mL无菌去离子水完全溶解，配制成100mg/mL MES置于_20°C下保存备用。
根据本发明的具体示例，步骤C中为含有200 μ M的乙酰丁香酮和1.0mg/mL的 2- (N-吗啉基)乙磺酸钠的Co-M培养基。
根据本发明的具体示例，步骤C中共培养培养基(Co-1M)的配方如下
磷酸氢钾缓冲液(K-buffer)，含K2HP04200g/L，KH2P04145g/L,用 H3PO4 调 ρΗ7· O,使用量为IOmL ；
硫酸镁-氯化钠溶液(M-Nbuffer)，含 MgSO4 · 7H20 30g/L 和 NaC115g/L，使用量为 20mL ；
20%葡萄糖(w/v)，20g葡萄糖溶解于70g去离子水中，定容至IOOmL,过滤除菌，使用量为5mL ；
其他成分包括l%CaCl2 · 2H20 (w/v) ImL, 20%NH4N03 (w/v) 2. 5mL,使用之前加入0.01%FeS04 (w/v) IOmL,补充去离子水至 IOOOmL,以 H3PO4 或 NaOH 调节 pH 至 7. O。
根据本发明的具体示例，步骤D (I)中为20mL含有50 μ g/mL潮霉素和300 μ g/mL 头孢霉素的PDA培养基。
根据本发明的具体示例，步骤D (2)和(3)中均为含有50 μ g/mL的潮霉素的PDA 平板。
根据本发明的具体示例，步骤D中制得的转化子保存在含有PDA斜面培养基的 1.5mL的离心管中，置于4°C冰箱中保存。
本发明的一个方面，提供一种苹果树腐烂病菌转化子，采用如上述方法制备。
本发明的另一个方面，提供一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株的制备方法，包括如下步骤
(I)以权利要求1中步骤B (I)的载体PBIG3C为框架，通过限制性内切酶Apa I和Sac I进行酶切；将经相同酶切处理的PtrpC-GFP-TtrpC表达盒连接到载体中，获得以潮霉素抗性标记基因为筛选标记，组成性表达egfp的表达载体命名为pHG-C。进一步的，利用特异性引物分别以质粒pEGFP-Cl和pAN52-l为模板扩增到egfp基因和来自于构巢曲霉Aspergillus nidulans的色氨酸合成酶基因启动子PtrpC及终止子TtrpC,获得 PtrpC-GFP-TtrpC表达盒，再经相同内切酶Apa I和Sac I酶切处理后连接到pBIG3C载体中，获得以潮霉素抗性标记基因为筛选标记，组成性表达egfp的表达载体命名为pHG-C ；
(2)将上述步骤(I)中构建的载体pHG-C转入农杆菌中，然后按权利要求1所述步骤B-D进行后续操作，在含潮霉素PDA平板上筛选获得转化子；
(3)利用荧光显微镜观察各转化子的菌丝体在488nm蓝色激发光源的激发下能否产生绿色荧光，将表达绿色荧光蛋白的转化子接种至含有50 μ g/mL潮霉素的PDA平板上， 连续培养三代得到稳定表达egfp的苹果树腐烂病菌转化子。
根据本发明的具体示例，按照上述方法保存苹果树腐烂病菌转化子。
本发明的另一个方面，提供一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株，采用如上述方法制备。本发明提供了一种简便的农杆菌介导的苹果树腐烂病菌转化子制备方法，同时还提供了一种高效的腐烂病菌GFP分子标记方法。具有的优点如下1.苹果树腐烂病菌诱导分生孢子的方法与已报道的腐烂病菌诱导产孢方法更为简单，可以直接在培养皿内产生分生孢子，无需其它药品及处理，更为经济，同时已经证实此方法适宜于不同致病力腐烂病菌菌株分生孢子的诱导。2.以腐烂病菌分生孢子为受体，无需制备原生质体，操作简便。3.以根癌农杆菌作为转化介体，具有转化效率高、转化子稳定且单拷贝频率高等优点。4.本发明的转化方法效率高，约IO3个分生孢子可以获得I个转化子，而已报道的 腐烂病菌分生孢子为受体进行的转化为每1. 67X IO5个分生孢子获得一个转化子，转化效率提高了约167倍。5.建立的ATMT转化方法应用广泛,适合于多种果树病原真菌。已在梨树腐烂病菌(Valsa mali)、苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)和楼桃干腐病菌(Phomopsisperniciosa)中得到验证。其它难以制备原生质体的丝状真菌，也可参考此说明方法。6.构建的组成性表达egfp载体pHG_C，利用本方法转化苹果树腐烂病菌后，96. 7%的转化子可表达强的绿色荧光蛋白，且遗传稳定性良好。利用本方法成功转化了多个不同致病力的苹果树腐烂病菌菌株，而且经多次重复实验具有相同转化效率，为构建腐烂病菌菌株T-DNA随机插入突变体库提供了高效的转化技术。这是国内外首次报道利用农杆菌介导转化苹果树腐烂病菌，获得大量稳定表达绿色荧光蛋白的腐烂病菌转化子。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
图1、实施例1中苹果树腐烂病菌LXS080901在大麦粒培养基上产生的分生孢子。图2、实施例1中所用质粒PBIG3C的图谱。图3、实施例1中腐烂病菌LXS080901部分转化子菌落形态(PDA，25°C，5d)。图中W为未转化的LXS080901野生型菌株，其余均为LXS080901的转化子。图4、实施例1中随机挑选腐烂病菌转化子潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的PCR扩增电泳图谱。图中泳道M DL2000DNA Maker ;泳道 CK :质粒 pBIG3C ;泳道 W LXS080901未转化的野生型菌株；泳道f 14 :腐烂病菌LXS080901菌株的转化子；泳道15 :无菌水对照图5、实施例1中随机挑选的转化子以潮霉素磷酸转移酶基因(hph)片段为探针进行的Southern杂交图谱。图中泳道M λ -Hind III digest DNA Marker ;泳道 CK Apa I 酶切的 pBIG3C 质粒；泳道W =Hind III酶切的腐烂病菌LXS080901野生型菌株基因组DNA ;泳道I 8 Hind III酶切的腐烂病菌LXS080901转化子基因组DNA。
图6、实施例2中随机挑取部分转化子的GFP荧光显微观察(3个连续继代5次的 GFP标记转化子)
图7、实施例2中部分转化子的潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和绿色荧光蛋白 (efpg)基因稳定性检测的PCR和RT-PCR扩增电泳图谱。图中
泳道M DL2000DNA Marker ;泳道 I, 11 :质粒 pBIG3C ;泳道 2，12 LXS080901 未转化的野生型菌株；泳道3-10:转化子hph基因的PCR扩增产物；13:不表达egfp基因的转化子；14-17:转化子的egfp基因的RT-PCR产物。
图8、实施例2中部分转化子的菌丝生长速率。
图9、实施例2中GFP标记苹果树腐烂病菌菌株对富士离体枝条侵染过程的显微观察。
图10、实施例3中梨树腐烂病菌LXS240101部分转化子菌落形态(PDA，25°C，4d)。 图中W为未转化的LXS240101野生型菌株，其余均为LXS240101的转化子。
图11、实施例3中部分梨树腐烂病菌转化子以潮霉素磷酸转移酶基因(hph)片段为探针进行的Southern杂交图谱。图中
泳道M λ -Hind III digest DNA Marker ;泳道 CK Apa I 酶切的 pBIG3C 质粒；
泳道W =Hind III酶切的梨树腐烂病菌LXS240101野生型菌株基因组DNA ;泳道 Γ3 =Hind III酶切的梨树腐烂病菌LXS240101转化子基因组DNA。
图12、实施例3中部分樱桃干腐病菌转化子潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的PCR 扩增电泳图谱。图中
泳道M DL2000DNA Marker ;泳道W LXS230101未转化的野生型菌株；泳道CK :质粒pBIG3C ;泳道1-9 LXS230101转化子hph基因的PCR扩增产物。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实例1:苹果树腐烂病菌菌株LXS080901的T-DNA随机插入突变体库的构建
1.转化受体苹果树腐烂病菌LXS080901分生孢子的制备
将保存的腐烂病菌菌株LXS080901接种在PDA培养基中，于25 °C恒温暗培养3天。 将活化后的苹果树腐烂病菌，打取菌饼(直径6mm)接种于下列6种培养基制备的平板上，继续置于25°C恒温箱暗培养。下述第6种培养基诱导产孢时,待腐烂病菌菌丝在PDA培养基上长满整个平皿后，放入灭菌的苹果枝条，并置黑光灯下(365nm)诱导。6种培养基的配方如下
(I)PDA培养基称取200g去皮马铃薯，加适量蒸馏水煮30min后用四层纱布过滤， 向滤液中加入葡萄糖20g，琼脂15g煮沸，补充蒸馏水至IOOOmL,分装后121°C灭菌30min。
(2)大麦粒PDA培养基将带壳大麦粒冲洗干净后，蒸馏水中浸泡lh，取70g浸泡过的大麦粒于250mL三角瓶中，加入l%(w/v)的蛋白胨20mL，6%(v/v)的蜂蜜20mL，混匀后置于121°C灭菌lh。PDA培养基制备方法同前，此大麦粒培养基与PDA培养基分开单独灭菌。 之后先倒I3DA平板，后将大麦粒均匀撒在上面，即为含大麦粒的PDA培养基。
(3)苹果树皮浆培养基取2 3年生富士苹果幼树枝干的树皮300g，组织匀浆后，加Λ IOg琼脂,用蒸懼水定容至IOOOmL,分装后灭菌。(4)燕麦片培养基称取燕麦片30g，煮沸后，加入琼脂15g，蒸馏水定容至IOOOmL,分装后灭菌。(5)苹果汁培养基成熟富士果实去皮，称取果肉组织300g，匀浆后四层纱布过滤，滤液中补加蒸馏水300mL，加入琼脂15g，分装后灭菌。(6)苹果枝条培养基取I年生富士苹果枝条剪成5cm小段，高压灭菌后放置于长满腐烂病菌菌丝的PDA平板上，每个平皿2 4个枝条。苹果树腐烂病菌LXS080901仅在大麦粒PDA培养基和灭菌苹果枝条上产生的子实体可溢出孢子角，在苹果枝条上诱导65天后仅5%的子实体能溢出孢子角，而在大麦粒PDA培养基上，20天左右即可见大量的橘黄色分生孢子角溢出，每个大麦粒平均可产生6个子实体，其中1. 8个子实体可溢出孢子角，每个孢子角含有约IO8个分生孢子，为利用腐烂病菌分生孢子进行遗传转化提供了足够的试材(见表I和图1)。表I苹果树腐烂病菌在6种培养基上的产孢数量
权利要求
1.一种制备苹果树腐烂病菌转化子的方法，其特征在于，包括以下步骤A.制备苹果树腐烂病菌分生孢子(1)将苹果树腐烂病菌接种于PDA培养基上，活化培养3天；(2)将活化培养的腐烂病菌打取菌饼接种于含有大麦粒的PDA培养基上，25°C恒温培养20-30天，至橘黄色分生孢子角溢出；B.培养农杆菌(1)将质粒PBIG3C转入农杆菌中；(2)取步骤B(I)中的农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB液体培养基中，28°C震荡培养I天；(3)取步骤B(2)中的农杆菌菌液于含卡那霉素的基本培养基中，28°C震荡培养2天， 测量菌液的OD6tltl值；(4)用含有乙酰丁香酮和2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的IM培养基稀释步骤B (3)中的农杆菌悬浮液至0D_值为O. 15，继续在28°C条件下振荡培养6h备用；C.根癌农杆菌与苹果树腐烂病菌分生孢子共培养(1)取步骤A(2)中的苹果树腐烂病菌分生孢子角至步骤B (4)中的农杆菌悬浮液中， 用农杆菌溶液稀释混合均匀，调节浓度至IO6个分生孢子/mL ；(2)将步骤C(I)中的农杆菌-腐烂病菌分生孢子混合液，按200 μ L/皿的量均匀涂布于铺有玻璃纸的含有乙酰丁香酮和2- (N-吗啉基)乙磺酸钠的Co-M培养基上，置于25°C 共培养3 5天；D.转化子的筛选及保存(1)将步骤C(2)中的玻璃纸放于一空的无菌培养皿中，使有菌丝的一面朝上，玻璃纸上面覆盖含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基，置于25°C恒温箱中培养3飞天；(2)将长出的腐烂病菌菌落转移至含有潮霉素的PDA平板中继续培养，将生长的菌落再次接种至含有潮霉素的PDA平板上，连续培养三代得到苹果树腐烂病菌转化子；(3)将得到的转化子保存在含有50μ g/mL潮霉素的PDA斜面培养基上，置于4°C低温保存。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中LB液体培养基为2mL含有50μ g/ mL卡那霉素、50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL链霉素的LB液体培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中农杆菌菌液与基本培养基的体积为0.25:50。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中为含50μ g/mL的卡那霉素的50mL 基本培养基。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中为含有200μ M的乙酰丁香酮和1.Omg/mL的2- (N-吗啉基)乙磺酸钠的頂培养基。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中为含有200μ M的乙酰丁香酮和1.Omg/mL的2- (N-吗啉基)乙磺酸钠的Co-頂培养基。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D(I)中为含有50 μ g/mL潮霉素和 300 μ g/mL头孢霉素的PDA培养基。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D(2)和(3)中为含有50 μ g/mL的潮霉素的PDA平板。
9.一种苹果树腐烂病菌转化子，其特征在于采用如权利要求1所述方法制备。
10.一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)以权利要求1中步骤B(I)的载体PBIG3C为框架，通过限制性内切酶Apa I和Sac I进行酶切，将经相同酶切处理的PtrpC-GFP-TtrpC表达盒连接到载体中，获得以潮霉素抗性标记基因为筛选标记，组成性表达egfp的表达载体命名为pHG-C ；(2)将上述步骤(I)中构建的载体pHG-C转入农杆菌中，然后按权利要求1中步骤B-D 进行后续操作，在含潮霉素TOA平板上筛选获得转化子；(3)利用荧光显微镜观察各转化子的菌丝体在488nm蓝色激发光源的激发下能否产生绿色荧光，将表达绿色荧光蛋白的转化子接种至含有50 μ g/mL潮霉素的PDA平板上，连续培养三代得到稳定表达egfp的苹果树腐烂病菌转化子。
11.一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株，其特征在于采用如权利要求10所述方法制备。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种苹果树腐烂病菌转化子及其制备方法。该方法将含有二元载体的根癌农杆菌与腐烂病菌的分生孢子悬浮液混合后共培养，用抗生素筛选，获得转化子。该方法以苹果树腐烂病菌的分生孢子为受体，以根癌农杆菌为介体，克服了苹果树腐烂病菌原生质体制备困难，且聚乙二醇(PEG)介导的转化效率低等原因导致的腐烂病菌遗传转化困难的问题。该方法的转化效率可达1/103个分生孢子。本发明同时提供了一种苹果树腐烂病菌绿色荧光蛋白(GFP)标记菌株及其制备方法，该方法获得的转化子，表达强的绿色荧光蛋白的效率可达96.7%。
文档编号C12N1/15GK102994401SQ201210431660
公开日2013年3月27日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者王彩霞, 李保华, 王海艳, 李桂舫, 董向丽, 张清明 申请人:青岛农业大学