专利名称：一种恶臭假单胞菌用培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种微生物培养基，特别是涉及一种用于培养恶臭假单胞菌的培养基。
背景技术：
硝基苯是化工行业的基本原料之一，主要应用于炸药、农药、染料等有机合成工业。由于硝基苯在水中具有较高的稳定性，一旦进入水体，就会造成水体较长时间的污染，另外，硝基苯毒性较强，不仅能够造成环境污染，而且一旦人吸入硝基苯蒸汽，还会引起急性中毒等。目前对硝基苯废水的处理方法主要有物理法、化学法和生物法。化学法和物理法处理硝基苯废水较多，但普遍存在二次污染和处理效果不理想等问题。生物法，特别是利用微生物处理该类废水是目前研究的热点。
有关硝基苯降解菌的研究已有文献报道，孙凌等(活性炭固定耐冷菌对硝基苯的降解特性，中国环境科学，2009，29(9) =941 - 945)用活性炭固定恶臭假单孢菌(.Pseudomonas putida)进行了硝基苯的降解研究。李明堂,徐镜波，卢振兰，等(两株细菌对邻氯硝基苯的协同降解[J]，环境科学学报，2010，30 (6) :1138 - 1143)研究结果表明Pseudomonas putida也可以降解对邻氯硝基苯。王琦等(硝基苯降解菌的筛选驯化及其最适降解条件研究，广东化工，2009，36 (11) =216-219)研究表明，随着硝基苯浓度升高，短杆菌属细菌对其降解效率降低，硝基苯浓度为500mg/L时，去除率仅为82%。王书航等(硝基苯降解菌筛选和鉴定，合肥工业大学学报，2008，31 (11) 1751 - 1754)研究表明，假单孢菌对初始质量浓度为25mg/L的硝基苯溶液经过168h培养，降解效率为81. 86%。王松等(硝基苯微生物降解的优化条件研究)研究了硝基苯初始浓度、PH值、重金属和NaCl浓度对硝基苯降解率影响，结果表明硝基苯的初始体积比为1000 μ L/L，pH=8, NaCl质量浓度50mg/L，ZnCl2质量浓度50mg/L时，硝基苯降解率可达72. 9%。但是，上述报道均存在微生物作用时间较长，降解效率不高，微生物对硝基苯的耐受性较低等问题。上述问题的本质是微生物数量少，培养条件差造成的。其原因是现在针对培养基的研究主要集中在菌种生长所需碳源、氮源和无机盐等常规营养元素上，并未考虑到培养基中假单孢菌生长过程中所需要的限制成份。
发明内容
本发明的目的是提供一种恶臭假单胞菌用培养基，以本发明的培养基培养出的恶臭假单胞菌培养时间快，生长速度快、菌株耐受性高，适应能力强。每IOOOmL本发明的恶臭假单胞菌用培养基中，各组分的含量分别为
牛肉膏7 13g，尿素2 5g，磷酸氢二钾2 3g，磷酸二氢钾O. 5 2g，氯化钙O. 3
1.2g，硝酸钠3. 4 5. 6g，微量元素和生长因子溶液I 5mL，去离子水余量。其中，所述的微量元素和生长因子溶液中含MoSO4 2.4 3. 6mmol/L，CuCl2 I. 5
2.8mmol/L, ZnCl2 3. O 4. OmmoI/L, FeSO4 4. 2 4. 8mmol/L，尿嘧啶 15 21mmol/L, VB620 35mmol/L, L-色氛酸 30 SOmmoI /I,η本发明制备得到的培养基的pH值范围调节为7. 5 8. 2。进一步地，每IOOOmL本发明的恶臭假单胞菌用培养基中，各组分的含量分别为 牛肉膏8. 6 10. 8g，尿素2. 3 4. 6g，磷酸氢二钾1.1 I. 7g，磷酸二氢钾O. 6
I. 7g，氯化钙O. 4 I. Og,硝酸钠3. 4 4. 3g，微量元素和生长因子溶液lmL，去离子水余量。优选地，每IOOOmL本发明的恶臭假单胞菌用培养基中含有牛肉膏10g，尿素4. 2g，磷酸氢二钾2. 96g，磷酸二氢钾O. 84g，氯化钙O. Sg,硝酸钠4g，微量元素和生长因子溶液lmL，去离子水余量。将恶臭假单胞菌株接入本发明的培养基，于27 32 °C，摇床转速120 150r/min下培养12 24h，即可得到高浓度铜绿假单孢菌液。 本发明根据恶臭假单胞菌的生理特性，筛选配制出了适合于恶臭假单胞菌生长的培养基，并在培养基中引入了 Mo2+，Cu2+，Zn2+，Fe2+，尿嘧啶，VB6, L-色氨酸等微量元素和生长因子。其中，无机盐有助于促进硝基苯降解相关酶类的合成和提高其酶活，促进微生物的生长速率，而尿嘧啶，VB6和L-色氨酸等有利于细胞的生长和分裂，从而提高了微生物对硝基苯的降解效率。本发明提供的培养基为恶臭假单胞菌提供了优良的生长环境，经本发明培养基培养的恶臭假单胞菌培养时间短，可在24h内达到较高浓度(0D值达2. O以上)，在自然条件下适应能力强，具有较高的活力及硝基苯降解能力，对硝基苯的降解效率特别是炸药废水中硝基苯的降解效率达94. 5%以上，同时还对含苯环和硝基类物质具有较高的耐受性。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步说明本发明。但不能将实施例理解为是对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据其内容对本发明进行的一些非本质的改进和调整，仍应属于本发明的保护范围。实施例I
分别称取 MoSO4 O. 52g, CuCl2 O. 26g, ZnCl2 O. 43g, FeSO4 O. 70g，尿嘧啶 2. 22g，VB65. 08g，L-色氨酸6. 35g，加入IOOOmL去离子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生长因子溶液。取牛肉膏8. 8g，尿素2. 6g，磷酸氢二钾2. 4g，磷酸二氢钾O. 9g，氯化钙O. 5g，硝酸钠3. Sg，微量元素和生长因子溶液2mL，加去离子水搅拌溶解完全后，以去离子水补足至IOOOmL,并调节培养基的pH值范围为7. 5 8. 2，得到恶臭假单胞菌用培养基。实施例2
分别称取 MoSO4 O. 64g, CuCl2 O. 34g, ZnCl2 O. 51g, FeSO4 0.68g，尿嘧啶 I. 92g, VB64. 53g，L-色氨酸9. 85g，加入IOOOmL去离子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生长因子溶液。取牛肉膏9. 6g，尿素3. 9g，磷酸氢二钾2. 5g，磷酸二氢钾I. 3g，氯化钙O. 8g，硝酸钠4. lg，微量元素和生长因子溶液2mL，加去离子水搅拌溶解完全后，以去离子水补足至IOOOmL,并调节培养基的pH值范围为7. 5 8. 2，得到恶臭假单胞菌用培养基。
实施例3
分别称取 MoSO4 O. 46g, CuCl2 O. 29g, ZnCl2 O. 48g, FeSO4 0.65g，尿嘧啶 I. 73g, VB67. 03g, L-色氨酸8. 27g，加入IOOOmL去离子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生长因子溶液。取牛肉膏10.(^，尿素3.38，磷酸氢二钾2.78，磷酸二氢钾L 6g，氯化钙O. 9g，硝酸钠3. 5g，微量元素和生长因子溶液2mL，加去离子水搅拌溶解完全后，以去离子水补足至IOOOmL,并调节培养基的pH值范围为7. 5 8. 2，得到恶臭假单胞菌用培养基。应用例I I、采集兴安化工厂硝化棉生产废水3mL，加入到IOOmL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30°C、120r/min的恒温摇床上振荡培养24h。取培养物lmL，转移到新鲜的同样牛肉膏蛋白胨培养基中，于30°C、120r/min的恒温摇床上振荡重复培养24h，得到富集培养液。2、移取ImL上述富集培养液，转接入含5mmol/L硝基苯的新鲜牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度30 V下培养48h后，取其中的培养物ImL转移到同样浓度硝基苯的新鲜牛肉膏蛋白胨培养基中，30°C下重复培养，至培养液浊度(0D值)达到1.2。3、在无菌条件下，用接种环蘸取上述含硝基苯的培养液，在实施例I的培养基上划线分离，于30°C恒温培养箱中培养72h后，得到独立的典型菌株。4、将菌种接入实施例I提供的培养基中，27 32°C下，摇床转速90 120r/min培养24 36h (对数期)，得到菌种，较平均培养时间缩短6 12h。5、取上述菌种5mL (0D值2. 2)，加入到含硝基苯300mg/L的IOOmL溶液中，30°C下，140r/min摇床振荡培养72h后测定硝基苯含量。经测定，硝基苯降解率为96. 1%。6、将上述菌种按伯杰氏手册进行菌种分类鉴定，经初步鉴定，该菌种为恶臭假单胞菌。应用例2
I、采集兴安化工厂硝化棉生产废水3mL，加入到IOOmL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30°C、120r/min的恒温摇床上振荡培养24h。取培养物lmL，转移到新鲜的同样牛肉膏蛋白胨培养基中，于30°C、120r/min的恒温摇床上振荡重复培养24h，得到富集培养液。2、移取ImL上述富集培养液，转接入含5mmol/L硝基苯的新鲜牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度30 V下培养48h后，取其中的培养物ImL转移到同样浓度硝基苯的新鲜牛肉膏蛋白胨培养基中，30°C下重复培养，至培养液浊度(0D值)达到1.2。3、在无菌条件下，用接种环蘸取上述含硝基苯的培养液，在实施例2的培养基上划线分离，于30°C恒温培养箱中培养72h后，得到独立的典型菌株。4、将菌种接入实施例2提供的培养基中，27 32°C下，摇床转速90 120r/min培养24 36h (对数期)，得到菌种，较平均培养时间缩短6 12h。5、取上述菌种5mL (0D值2. 4)，加入到含硝基苯500mg/L的IOOmL溶液中，32°C下，120r/min摇床振荡培养72h后测定硝基苯含量。经测定，硝基苯降解率为95. 2%。6、将上述菌种按伯杰氏手册进行菌种分类鉴定，经初步鉴定，该菌种为恶臭假单胞菌。
权利要求
1.一种恶臭假单胞菌用培养基，每IOOOmL培养基中含有 牛肉膏7 13g，尿素2 5g，磷酸氢二钾2 3g，磷酸二氢钾O. 5 2g，氯化钙O. 3 1.2g，硝酸钠3. 4 5. 6g，微量元素和生长因子溶液I 5mL，去离子水余量； 其中，所述的微量元素和生长因子溶液中含MoSO4 2. 4 3. 6mmol/L，CuCl2 I. 5 2.8mmol/L, ZnCl2 3. O 4. OmmoI/L, FeSO4 4. 2 4. 8mmol/L，尿嘧啶 15 21mmol/L, VB620 3Smmol /T,, L-色氛酸 30 SOmmoI /I,； 调节培养基的PH值范围为7. 5 8. 2。
2.根据权利要求I所述的恶臭假单胞菌用培养基，每IOOOmL培养基中各组分的含量分别为牛肉膏8. 6 10. 8g,尿素2. 3 4. 6g,磷酸氢二钾2. 2 2. 7g,磷酸二氢钾O. 6 I. 7g，氯化钙O. 4 I. Og,硝酸钠3. 4 4. 3g，微量元素和生长因子溶液lmL，去离子水余量。
3.根据权利要求I所述的恶臭假单胞菌用培养基，每IOOOmL培养基中各组分的含量分别为牛肉膏10g，尿素4. 2g，磷酸氢二钾2. 96g，磷酸二氢钾O. 84g，氯化钙O. Sg，硝酸钠·4g,微量兀素和生长因子溶液ImL,去尚子水余量。
全文摘要
一种恶臭假单胞菌用培养基，每1000mL培养基中含有牛肉膏7～13g，尿素2～5g，磷酸氢二钾2～3g，磷酸二氢钾0.5～2g，氯化钙0.3～1.2g，硝酸钠3.4～5.6g，微量元素和生长因子溶液1～5mL，去离子水余量，其中微量元素和生长因子溶液中含MoSO42.4～3.6mmol/L，CuCl21.5～2.8mmol/L，ZnCl23.0～4.0mmol/L，FeSO44.2～4.8mmol/L，尿嘧啶15～21mmol/L，VB620～35mmol/L，L-色氨酸30～50mmol/L。本发明提供的培养基为恶臭假单胞菌提供了优良的生长环境，使用本发明培养基培养恶臭假单胞菌培养时间快，菌株耐受性高，适应能力强，对硝基苯的降解效率达94.5%以上，同时还对含苯环和硝基类物质具有较高的耐受性。
文档编号C12R1/40GK102888378SQ201210432500
公开日2013年1月23日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者郭峰波, 贾万利, 李颖 申请人:中北大学