专利名称：尖吻蝮蛇血凝酶-b的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶-B，本发明还涉及其分离纯化方法。
背景技术：
蝮亚科(Crotalinae)蛇毒中存在一类与血液凝固相关的蛋白酶，通常称之为“类凝血酶”(thrombin-like enzyme,简称TLC)。类凝血酶与凝血酶(thrombin)的表观作用相似，均可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而“凝固”。然而，两种酶作用机理不同，类凝血酶不激活凝血系统中X III因子，其与纤维蛋白原作用仅产生非交联纤维蛋白，不会导致血栓形成，其形成的凝血块可被5M尿素溶解；而凝血酶能够激活凝血系统中X III 因子，其与纤维蛋白原作用形成交联纤维蛋白，可导致血栓形成，其形成的凝血块不能被5M尿素溶解。近50年来的科学研究发现在40多种蛇毒中含有类凝血酶成分，有30余种得到分离纯化，其中有10余种类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到阐明。已发现的TLC分子量多在29 45kD之间，大多数为酸性糖蛋白。在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链。其商品化典型代表产品“立 Ε雪”(Reptilase)系由瑞士 Solco Basle公司生产，是由巴西矛头蝮蛇(Bothrops.atiOx)蛇毒中分离出的一种凝血酶，该酶前体由255个氨基酸构成，N端有24个氨基酸形成的引导肽，活性酶含231氨基酸，SDS-PAGE分子量34kD。含6个链内二硫键(位点7_139，26-42,74-230,1 18-184，150-163，174-199)，为单链糖蛋白(糖基化位点为 Asn146’ 225)，脱去糖基后的分子量为255 17Da。另一个已经商品化的产品是意大利RAVIZZ公司生产的“Botropase”,该凝血酶是从美洲矛头蝮蛇(Bothrops. jararaca)蛇毒中分离得到的。活性酶含231氨基酸，在氨基酸序列上与Iteptilase比较在14个位点上有差别。此外，国内学者沈居仁等2006年从中国尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离得到一种高活性血凝酶，该酶为单链，SDS-PAGE分子量36±2kD，等电点为6. 59，比活为2000U-3000U/mg，N-末端15个氨基酸序列为VIGGNECDTNEEHFL。以蛇毒原料重量计收得率为O. 03%。到目前为止，商品化的蛇毒血凝酶种类较少，因此寻找适合产业化的高活性高收率的蛇毒血凝酶新品种尤显必要。本发明人从我国广西尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus,俗称五步蛇)的蛇毒中分离纯化得到一种高活性血凝酶-B。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛇毒血凝酶-B，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种类凝血酶(TLC)。本发明的另一个目的在于提供了一种分离纯化上述血凝酶-B的方法。
本发明血凝酶-B是从中国尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离得到的高活性血凝酶(命名为“血凝酶-B”)，其具有SEQ ID No. I所示的氨基酸序列。该酶具有如下特征①由236个氨基酸构成的单链，SDS-PAGE分子量约为35kD，等电点pi为6. 0，②含6个链内二硫键(位点7-141，28-44，78-234，120-188，152-167，178-203)。③在 Asn77’100’229位点上具有由5种不同单糖构成的杂合多聚糖修饰。④酶活性可被苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。⑤具有较好的热稳定性，40°C恒温60天酶活性可保持 90%ο应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的 氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明蛋白还包括SEQ ID No. I所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白质。本领域技术人员可以根据本发明血凝酶-B的N端氨基酸序列，设计合成寡核苷酸探针，从尖吻蝮蛇毒腺组织提取mRNA，反转录并构建cDNA文库，通过上述探针筛选cDNA文库，并对筛选出的阳性克隆子分别进行测序克隆分析，从而得到编码本发明蛋白的基因。也可以根据本发明血凝酶-B的氨基酸序列直接设计合成编码本发明蛋白的基因。本发明还提供上述血凝酶-B的纯化方法，其包括如下步骤I)、蛇毒预处理；2)、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE — Sephrose FF阴离子交换层析柱，用 O. OlM pH7. O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02 和 O. 06M NaCl 的 O. OlM pH7. O 7. 5的PBS分段洗脱，收集O. 06MNaCl溶液的洗脱液；3)、将上述洗脱液超滤浓缩至小体积后经透析去除NaCl ；4)、将透析后的溶液再次上样至经过预平衡的DEAE — S^hrose FF层析柱，用O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02,0. 04,0. 06Μ NaCl 的 O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的PBS分段洗脱，收集O. 06Μ NaCl溶液洗脱液中的第三个洗脱峰；5)、将上述收集液超滤浓缩至小体积后经80%硫酸铵沉淀，12000g离心30分钟分
离沉淀。6)、用PBS适量溶解沉淀,经Sephadex_G75进一步纯化,再经透析除盐后直接冷冻干燥。其中，步骤I)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的O. 01MpH7. O 7. 5PBS溶解，离心取上清液进行透析(透析袋截留分子量为7，000D 10，000D)。通过预处理可以去除不溶的杂质以及小分子多肽，并降低溶液离子强度。具体地说可通过如下步骤进行蛇毒的预处理称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍体积预冷的O. OlM pH7. O 7. 5的PBS于4 8 V的层析柜中搅拌溶解3(Γ60分钟，于O0C >5, 000^10, OOOg离心1(Γ20分钟，将离心上清液倾入透析袋中，离心沉淀再次加入蛇毒重量5 10倍体积预冷的PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液于透析袋中，于4 8C对O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS透析12 24小时，期间换液2 4次，以去除小分子多肽和降低溶液离子强度。其中，步骤2)和步骤4)采用O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS预平衡DEAE — SephroseFF层析柱，然后再上样。
其中，步骤3)透析的目的是去除溶液中存在的NaCl。步骤3)和步骤5)中大体积洗脱液浓缩方式为超滤浓缩(膜截留值5000-10000Da)。其中，步骤6)中采用S印hadeX_G75分子筛的目的是进一步将两次阴离子柱层析收集物中的蛋白质按分子量大小进行分离纯化。具体地将沉淀用PBS溶解后上柱，用O. OlMpH7. 4PBS洗脱液洗脱，收集洗脱液第一个峰。经本发明方法纯化的血凝酶-B比活力不低于2000U/mg，还原和非还原SDS-PAGE均为一条带；HPLC分析纯度95%以上。该酶具有较好的热稳定性，40°C恒温60天酶活性可保持90%。以蛇毒冻干粉原料重量计，本法纯化收得率为O. 25% - O. 3%。本发明血凝酶-B具有良好的凝血活性，可作为制成各种止血药物的原料药，即本发明还包括含有所述尖吻蝮蛇血凝酶-B的止血药物。该药物可以是冻干粉原药、冻干粉注射剂、止血贴剂、止血粉剂、止血片剂、止血膏剂或者止血液体喷雾剂，用于需要止血以减少出血量的各种医疗情况。也可用来预防出血，避免或减少手术部位及手术后出血。
图I显示纯化后血凝酶-B的SDS-PAGE —条带。图2显示纯化后血凝酶-B的HPLC分析结果。图3血凝酶-B杂合糖基化结构示意图。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术。本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分t匕，除另有规定外，是指溶液IOOml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时容量的比例。本发明中类似“用蛇毒重量10倍体积预冷的”表述，其中的重量和体积的单位分别是g和ml。实施例I蛇毒血凝酶-B的纯化取30g尖吻蝮蛇蛇毒冻干粉(批号20090701，广西蛇毒研究所)，用蛇毒重量10倍体积预冷的O. OlM pH7. 4的PBS于4°C的层析柜中搅拌溶解30分钟，于4°C、IOOOOg离心15分钟，将离心上清液倾入透析袋中，离心沉淀再次加入蛇毒重量10倍体积预冷的PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液于透析袋(截留分子量为10，000D)中，在4°C层析柜中对O. OlM pH7. 4的PBS透析24小时，期间换液3次。将预处理后的蛇毒溶液上样到经过O. OlM pH7. 4PBS预平衡的DEAE — Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱,先用O. OlMpH7. 4PBS洗柱，再分别用含O. 02Μ、0. 06Μ NaCl的O. OlM ρΗ7. 4的PBS分段洗脱，收集O. 06ΜNaCl溶液的洗脱峰，共得1960ml。经酶活测定(参照附录①或②方法)和电泳分析，目的物出现在O. 06M NaCl溶液的洗脱峰收集液中。采用Millipore Pellicon 2切向流超滤器(O. IM2CUt off IOk膜)超滤浓缩至200ml，将该200ml超滤浓缩液倾入透析袋(10，000D)中，用2000ml O. OlM pH7. 4的PBS于4°C透析24小时，期间更换溶液3次。将透析后的酶溶液上样到经过预平衡的DEAE — Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱,用O. OlM pH7. 4的PBS洗柱,再分别用O. 02M、0. 04M、0. 06M NaCl 的 O. OlM ρΗ7· 4 的 PBS 分段洗脱，收集 O. 06Μ NaCl 溶液洗脱液的第三个洗脱峰，共得660ml。用Millipore Pellicon 2切向流超滤器(O. IM2CUt off 5k膜)超滤浓缩至120ml，将该120ml经80%硫酸铵沉淀4°C过夜，次日12，OOOg 4°C离心30分钟，离心沉淀用IOml的O. OlM pH7. 4PBS悬浮溶解，立即上样到S印hdex_G75层系柱，用O. OlMpH7. 4PBS洗脱液洗脱，收集洗脱液第一个峰65ml，经酶活测定确认存在目的产物。将该65ml浓缩液装入透析袋中，用无离子水进行透析24小时，期间更换溶液3次，每次2000ml。透析后体积为73ml，直接冷冻干燥。获得冻干物81mg，测定酶比活为2500U/mg，最终收率O. 27%。还原和非还原SDS-PAGE均为一条带(见图1)，电泳分子量大致为35kD。HPLC纯度96.2% (见图2)。等电聚焦电泳测定该酶等电点pi为6. O。经Edman酶解和肽图质谱进行氨基酸和糖基化测定，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。该血凝酶含236个氨基酸，仅按氨基酸计算分子量为26116. 7Dalton ;链内含6个
一 XiT 蚀 /-i-. I- Wr n 7 n 141 η 28 η 44 η 78 η 234 η 120 η 188 η 152 η 167 η 178 η
—硫键，位点为Cys-Cys，Cys -Cys，Cys -Cys，Cys -Cys，Cys -Cys，Cys -Cys2°3。糖基化位点为Asn77G2F4S，Asn1(l° - Hybrid, Asn229_G2F4S，糖基化结构由5种不同单糖的杂合多聚糖构成(见图3)。实施例2蛇毒血凝酶-B的纯化取30g尖吻蝮蛇蛇毒冻干粉(批号20090701，广西蛇毒研究所)，按与实施例I相同的方法进行预处理。将经预处理的蛇毒溶液按实例I相同的方法进行第一次DEAE-Sephrose FF柱层析，经酶活测定和电泳分析目的物出现在O. 06MNaCl的洗脱峰中，合并洗脱收集液，共得2000ml,采用Millipore Pellicon 2切向流超滤器(O. IM2CUtofflOk膜)超滤浓缩至210ml，将该210ml超滤浓缩液倾入透析袋(10，000D)中，用2000ml O. OlM pH7. 4PBS于4°C透析24小时，期间更换溶液3次。透析后的酶液上样至DEAE-Sephrose FF柱中，按实例I相同的方法进行第二次层析。血凝酶出现在O. 06MNaCl溶液洗脱液的第三个洗脱峰中，收集该峰洗脱液得648ml。用Millipore Pellicon 2切向流超滤器(O. IM2CUt off 5k膜)超滤浓缩至130ml,将该130ml经80%硫酸铵沉淀4°C过夜，12，OOOg 4°C离心30分钟，沉淀用IOml的0.01M pH7. 4PBS悬浮溶解，立即上样到Sephdex-G75层系柱，收集洗脱液第一个峰68ml，经酶活测定确认。将该68ml按实例I相同的方法进行透析后体积为78ml，直接冷冻干燥。获得冻干物85mg，测定酶比活力为2460U/mg，最终收率O. 28%。SDS-PAGE为一条带，其电泳分子量大致为35kD。HPLC纯度96. 0%。实施例3尖吻蝮蛇血凝酶-B的丝氨酸蛋白属性实验将实施例I分离得到的血凝酶-B用生理盐水稀释至酶活lU/ml。用生理盐水配制I %的牛纤维蛋白原(Sigma公司)溶液。用异丙醇溶解苯甲基磺酰氟(PMSF, Merck公司),溶液浓度为4mg/ml。实验操作步骤如下(I)取1%牛纤维蛋白原溶液2ml，37°C下恒温5分钟。(2)取三支小试管，分别标注1#、2#、3#，每管加入20(^1的lU/ml血凝酶-C溶液。(3)分别向1#试管加入10 μ I蒸馏水，2#试管加入10 μ I异丙醇，3#试管加入10 μ I PMSF,于37° C水浴保温5分钟。(4)按试管编号顺序分别单独进行凝集试验观察。向试管中加入恒温好的1%牛纤维蛋白原溶液200 μ 1，立即计时，同时轻轻摇动混匀，于37°C水浴中静置，观察试管中凝集反应的情况。以溶液呈现完全凝固状态时终止计时。结果见表一表一、PMSF对凝集时间的影响
权利要求
1.尖吻蝮蛇血凝酶-B，其具有SEQID No. I所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸得到的具有同等功能的氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的尖吻蝮蛇血凝酶-B，其特征在于，链内含有6对二硫键，在Asn77'100' 229位点上具有杂合多聚糖修饰。
3.含有权利要求I或2所述尖吻蝮蛇血凝酶-B的药物。
4.如权利要求3所述的药物，其为冻干粉原药、冻干粉注射剂、止血贴剂、止血粉剂、止血片剂、止血膏剂或止血液体喷雾剂。
5.权利要求I或2所述血凝酶-B的纯化方法，其包括如下步骤 1)、蛇毒预处理； 2)、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE— S^harose Fast Flow阴离子交换层析柱，用 O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 2 和 O. 6Μ NaCl 的 O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS分段洗脱，收集O. 06MNaCl溶液的洗脱峰； 3)、将上述洗脱液超滤浓缩后透析去除NaCl； 4)、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE— Sepharose Fast Flow层析柱,用O. OlMpH7. O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02,0. 04,0. 06M NaCl 的 O. OlM pH7. O 7. 5 的 PBS 分段洗脱，收集O. 06M NaCl溶液的第三个洗脱峰； 5)、将上述洗脱收集液用80%硫酸铵沉淀，离心收集沉淀； 6)、用PBS适量溶解沉淀,经Sephadex_G75进一步纯化,再经透析除盐，冷冻干燥。
6.如权利要求5所述的方法，其中，步骤I)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的O.OlM pH7. O 7. 5的PBS溶解，离心取上清液进行透析。
7.如权利要求5所述的方法，其中，步骤I)蛇毒预处理的方法是称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍体积预冷的O. 01MpH7. O 7. 5的PBS于4 8°C的层析柜中搅拌溶解30 60分钟，于4°C、5，000^10, OOOg离心1(Γ20分钟，将离心上清液倾入透析袋，离心沉淀再用蛇毒重量5 10倍体积预冷的PBS搅拌悬浮，再次离心，合并两次离心上清液装入透析袋中，于4 8。。对O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS透析12 24小时，期间更换溶液2 4次。
8.如权利要求5所述的方法，其中，步骤2)和步骤4)采用O.OlM ρΗ7. O 7. 5的PBS预平衡DEAE — Sepharose Fast Flow层析柱,然后上样。
9.如权利要求5 8任一项所述的方法，其中，步骤3)采用分子截留值为5，00(T10，000D的超滤膜进行超滤浓缩。
10.如权利要求51任一项所述的方法，其中，步骤6)纯化的方法是将步骤5)收集的沉淀用PBS溶解后，上SephadeX-G75层析柱，用O. OlM pH7. 4PBS洗脱液洗脱，收集洗脱液第一个峰。
全文摘要
本发明提供了一种尖吻蝮蛇血凝酶-B，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离到的一种高活性血凝酶，该酶为由236个氨基酸组成的单链糖蛋白，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。链内含有6对二硫键；SDS-PAGE分子量约35kD，脱糖基化后的酶分子量26116.7Da；等电点pI 6.0。酶分子在Asn77,100,229位点上具有杂合多聚糖修饰。该酶为丝氨酸蛋白酶。本发明还提供了该酶的分离纯化方法，包括通过预处理去除不溶物，再通过两次阴离子交换柱层析和一次Sephdex-G75分子筛层析，收集活性洗脱峰，经透析、冻干，即得高纯度蛇毒血凝酶。其比活力不低于2000U/mg，HPLC分析纯度可达95%以上，以蛇毒原料重量计收得率为0.25%－0.30%。
文档编号C12N9/74GK102925422SQ20121045898
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者孙狄, 王锡娟 申请人:北京康辰药业有限公司