专利名称：双峰驼溶菌酶蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼溶菌酶蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。
背景技术：
溶菌酶(Iysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一种特异性地作用于细菌细胞壁的水解酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β -1, 4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
人们主要以鲜奶的形式饮用驼乳，并在长期的生活实践中发现驼乳具有更长的保存期。这一点引起了广大学者的兴趣，诱发人们去研究驼乳中的保护性蛋白。同时，将驼乳用来治疗某些感染性疾病的事实也暗示了它所含有的抗微生物成分。Elagamy等报道，驼乳除了拥有与牛奶相似的各种营养物质外，还有很高的生物学价值，即驼乳中含有大量的诸如溶菌酶，乳铁蛋白和免疫球蛋白等保护性蛋白。溶菌酶不仅能裂解细菌的细胞壁，而且还能增强抗体活性，因此溶菌酶是一种具有杀菌作用的乳蛋白。Elagamy等报道驼乳中的溶菌酶含量是牛奶的4. 9倍，是水牛乳中的11倍。Barbour等研究了驼乳的抗菌作用与其溶菌酶含量的关系。在200份乳样中发现有20个抑制了六种病原菌中的一个或多个病原菌的生长。并且这20个具有抗菌作用的样品中溶菌酶含量达648 μ g/1OOmL,明显高于无抗菌作用的乳样溶菌酶含量(62. 6 μ g/100mL)。人乳的溶菌酶含量为40000 μ g/100mL、牛乳为120 μ g/100mL。Elagamy (2000)报道，驼乳中除了拥有与牛奶相似的各种营养物质外，溶菌酶、乳铁蛋白和免疫球蛋白等保护性蛋白含量均高于牛乳。El-Sayed等(1992)的研究结果发现驼乳中的溶菌酶可抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长发育，而且与卵清蛋白有相同的抗菌谱，但与牛奶中的溶菌酶的抗菌谱不一样。Duhaiman等报道，与G-菌(埃希氏菌属)相比，G+菌(微球菌属)对驼乳溶菌酶更为敏感。El Sayed等研究发现驼乳溶菌酶可抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长发育，而且与卵清蛋白有相同的抗菌谱，但与牛奶的溶菌酶的抗菌谱不一样。双峰驼驼乳中的溶菌酶含量明显高于牛乳和水牛乳，且可以有效的抑制病原菌的生长，但是目前国内外对驼乳中溶菌酶的研究甚少。
发明内容
本发明提供了一种双峰驼溶菌酶蛋白基因，该基因是一种具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增强抗体活性密切相关的基因。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种双峰驼溶菌酶蛋白基因，该基因是一种具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增强抗体活性密切相关的基因，具有SEQ IDNO.1中从核苷酸第27-481位的核苷酸序列。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种双峰驼溶菌酶蛋白基因的
重组蛋白。下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进
上述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。上述重组蛋白为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
上述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼溶菌酶蛋白中得到双峰驼溶菌酶蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的一种双峰驼溶菌酶蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行第一步，组织分离(Isolation);第二步,总RNA的分离(TotalRNA isolation),总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。本发明通过双峰驼的溶菌酶序列及进化树可以直观的表现出双峰驼溶菌酶序列与其他物种此蛋白序列的差异，为以后研究双峰驼及其他物种的溶菌酶对细菌细胞壁的水解作用的研究提供实验数据，对研究双峰驼及其他物种以及人类溶菌酶与带负电荷的病毒蛋白结合并使之失活提供一定的理论依据并对溶菌酶在人类的抗菌、消炎、抗病毒的作用研究起到了很重要的作用，因此本发明具有很大的应用价值。
附图1为本发明双峰驼溶菌酶蛋白基因RT-PCR产物电泳图。附图2为双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的溶菌酶基因编码氨基酸序列同源性比较结果图。附图3为本发明双峰驼溶菌酶氨基酸序列与人、鼠、牛等动物溶菌酶氨基酸序列构建的系统进化树图。
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1 :一种双峰驼溶菌酶蛋白基因，该基因是一种具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增强抗体活性密切相关的基因，具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第27-481位的核苷酸序列。实施例2 :—种双峰驼溶菌酶蛋白基因的重组蛋白。实施例3 :重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。实施例4 :重组蛋白为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。实施例5 :重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。实施例6 :重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼溶菌酶蛋白中得到双峰驼溶菌酶 蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID N0.3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。实施例7 :—种双峰驼溶菌酶蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行第一步，组织分离(Isolation);第二步，总 RNA 的分离(Total RNA isolation),总 RNA 的分离(TotalRNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全长 cDNA 的克隆(Cloning ofFull-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。双峰驼溶菌酶蛋白基因cDNA序列的克隆1. 组织分离(Isolation)
从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于-70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。2.总 RNA 的分离(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的准备工作
玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180°C烘烤4小时。匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20分钟至30分钟，再用0. 1%的DEPC水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5%的SDS处理。Tip头、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。(2 )组织总RNA提取
取IOOmg在液氮中冻存的组织样放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogenBRL, USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000g离心10分钟，吸取上清液，15°C至30°C温育5分钟，加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15°C至30°C温育2分钟至3分钟，4°C12000g离心15分钟；吸取上清液，加0. 8ml异丙醇，混合均匀；15°C至30°C温育10分钟，4°C 12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA ;倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗涤RNA,40C 7500g离心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA ;溶于水(RNase free)中分装，_70°C保存。(3)组织总RNA的鉴定
通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下电泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4小时至5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入IXTBE待用，琼脂糖凝胶用IXTBE配制；在IOul上样缓冲液(2XTBE，13%菲可，O. 1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2分钟至3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。·3.全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)
(1)引物设计及合成
根据GenBanK发表的人(Accession No: MC63078.1)、鼠(Accession No: 038618.1)、牛(Accession No: AAC37312.1)等物种的溶菌酶基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼溶菌酶cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼溶菌酶蛋白基因cDNA序列；引物用Primer Premier 5. O自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成,该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3 (正向WPSEQ ID NO:4 (反向)，序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’
(2)RT-PCR 扩增
按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录；反转录反应液组成IOul 2 XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, lul dNTP Mixtur, 0. 5ul RnaseInhibitor (40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul), lul Oligo dT Primer,lul RNASample,1. 5ul Rnase Free dH20，总体系为 20 ul。反转录反应条件65°C I 分钟，30°C 5分钟(15分钟至30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5V 5分钟；PCR扩增条件970C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72V I分钟，如此进行30次循环；72°C延伸10分钟，4°C保存。(3)克隆和测序
PCR扩增片段的回收片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1. 5mlEP管中；按每IOOmg琼脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟；将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOg离心I分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg离心15秒；倒掉管中液体，在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体；离心I分钟，将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置I分钟后，IOOOOg离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA。回收片段同T载体的连接连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒，操作过程如下在 EP 管中制备下列连接反应液pMD 18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul, DNA 20_40ng，Solution I 5ul，加dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。质粒的转化 从_70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。IOOul感受态细胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟；取IOOul铺于LB平板上，平板含O. 1%(V/V)的氨节青霉Amp (100mg/ml), 37°C恒温培养10小时至15小时。转化菌落的PCR鉴定与培养用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker —起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入O. 1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。质粒的回收质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下将转化培养的菌液加入1. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温 和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，静置I分钟，离心15秒，倒掉液体。离心I分钟，将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置I分钟后，离心I分钟，EP管中液体即为回收的质粒。质粒的酶切鉴定为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定。本研究具体操作如下根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I和Hin d III,保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系Bam H I lul, Hind III lul，10XK Buffer 2ul，DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul。30°C反应 3 小时，琼脂糖凝胶电泳检测。重组质粒的测序取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。双峰驼溶菌酶蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建1、双峰驼溶菌酶的序列信息与生物信息学分析
本发明双峰驼溶菌酶⑶S的长度为504 bp，详细序列见SEQ ID NO:1。根据全长⑶S推导出双峰驼溶菌酶的氨基酸序列，共151个氨基酸残基，详见SEQ ID N0:2，在线预测(http://www. expasy. ch/tools/pi_tool. html)结果显不，其分子量为 16997. 47 道尔顿，等电点(PI)为8. 81。2、溶菌酶基因编码序列系统发生树构建
在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等九种物种的九条溶菌酶基因的编码蛋白序列，力口上本发明获得的SEQ ID N0.2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树见附图
3;双峰驼溶菌酶氨基酸序列与人、鼠、牛等物种氨基酸的相似性见表一。本发明在提供了双峰驼溶菌酶蛋白基因的cDNA序列和蛋白编码序列基础上；将人、鼠、牛等不同物种溶菌酶基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较；对包括双峰驼在内的十个物种的十个溶菌酶基因的CDS序列构建了系统发生树。本发明中的双峰驼溶菌酶基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的溶菌酶基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼溶菌酶基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼溶菌酶基因cDNA序列中的编码序列(⑶S)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO. 2。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为504bp，电泳结果见附图1，其中27_29位为起始密码子ATG，479-481位为终止密码子TAA，27-481位为编码蛋白质区域(⑶S)。在SEQ ID NO. 1，双峰驼溶菌酶基因编码151个氨基酸。双峰驼与鼠、人、牛等溶菌酶氨基酸相似性见表一。双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的溶菌酶基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。其中十种动物溶菌酶氨基酸个数及分子量见表二。其中十种动物溶菌酶氨基酸比例见表三。本发明提供了双峰驼溶菌酶的核酸序列，该核酸序列为SEQ ID NO. 1，本发明还提供了一种分离出的溶菌酶的氨基酸序列，该序列的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。对包括SEQID NO.1在内的10个物种的10条溶菌酶基因的氨基酸序列构建了系统发生树，结果发现，双峰驼与牛、羊的亲缘关系最近。
我们参考了其他九种动物的溶菌酶基因序列，克隆并测序得到了双峰驼驼乳中溶菌酶基因的cDNA序列，并对包括双峰驼在内的十种物种基因的CDS序列进行同源性比较并作进化树，为今后研究双峰驼驼乳中溶菌酶提供基础资料。以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。序列 表
<110>新疆旺源驼奶实业有限公司
〈120〉双峰驼溶菌酶的蛋白编码序列
〈160〉 4
〈210〉 I
〈211〉 504
〈212〉 DNA
〈213〉阿拉善盟双峰驼 〈400〉 I
atcccagtgt gtagacggct gcaaccatga aggctctcct tgtgctgggg ctcgtcctcc60
tcgctgtcgc cgtgcagggc aaggtctggg agagatgcga gctggcccga aagctgaagg120
aactcggaat ggatggctac aggggagtca gcgtggccga ctggatgtgt ttggccagat180
gggaaagtaa ttatgacacg aaagctacaa acttcaatcc ctccagcaga agcactgatt240
atgggatatt tcagatcaac agccgctact ggtgtaacga tggcaaaact ccaaaagcag300
tgaacggctg tggcatcaac tgtaacggtg actctgacaa aattgctgaa gcaagacatt360
tcttcttttc aacggctatg agctatttct caactctgat tatgcatgag atcgtcaaag420
cttcatccta cagttaccgt atcagacact tgggagtaga tgtaagtaac ctgtatgctt480
[Iagatatattt ttatacaaaa aaaa504
〈210〉 2 〈211〉 151 〈212〉 PRT
〈213〉阿拉善盟双峰驼
权利要求
1.一种双峰驼溶菌酶蛋白基因，其特征在于该基因是一种具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增强抗体活性密切相关的基因，具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第27-481位的核苷酸序列。
2.一种根据权利要求1所述的双峰驼溶菌酶蛋白基因的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的核苷酸序列为SEQID NO.1。
4.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白为SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
6.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列为SEQID NO. 2。
7.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼溶菌酶蛋白中得到双峰驼溶菌酶蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。
8.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼溶菌酶蛋白中得到双峰驼溶菌酶蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。
9.根据权利要求5或6所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼溶菌酶蛋白中得到双峰驼溶菌酶蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。
10.一种根据权利要求1所述的双峰驼溶菌酶蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行 第一步，组织分离(Isolation);第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation),总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼溶菌酶蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法；该基因是一种具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增强抗体活性密切相关的基因，具有SEQIDNO.1中从核苷酸第27-481位的核苷酸序列。本发明通过双峰驼的溶菌酶序列及进化树可以直观的表现出双峰驼溶菌酶序列与其他物种此蛋白序列的差异，为以后研究双峰驼及其他物种的溶菌酶对细菌细胞壁的水解作用的研究提供实验数据，对研究双峰驼及其他物种以及人类溶菌酶与带负电荷的病毒蛋白结合并使之失活提供一定的理论依据并对溶菌酶在人类的抗菌、消炎、抗病毒的作用研究起到了很重要的作用，因此本发明具有很大的应用价值。
文档编号C12N9/36GK103014038SQ20121047826
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司