专利名称：美国白蛾核型多角体病毒生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种美国白蛾核型多角体病毒的生产工艺，其用于防治美国白蛾，属于林木害虫一美国白蛾生物防治领域。
背景技术：
美国白蛾(Hyphantria cunea)属鳞翅目灯蛾科昆虫,是国际上重要的检疫对象，是多种林木、果树和农作物的危险性害虫。1979年传入我国以来，先后在辽宁省丹东、山东荣成、烟台、陕西武功、天津、河北秦皇岛等地区爆发成灾。由于其繁殖力强(每个卵块500-2000粒卵)，食性杂(可危害200多种植物)，又具有暴食性以及其成虫具有较强的迁飞习性等特点，对我国的农、林业、养蚕业和城市园林造成很大的威胁。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)多次共同推荐昆虫杆状病毒用于大面积防治农林害虫，并将其列为二十一世纪首选的生物农药开发对象。美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)属杆状病毒科，核型多角体病毒属，是实现美国白蛾持续控制的重要措施，其宿主专一性强、毒力和稳定性高、不污染环境、对生态系统中的其他非靶标生物安全，是控制害虫种群数量变动的重要生物因子，不仅可以通过感病幼虫的排泄物和尸体进行水平扩散，而且能够通过产卵方式进行垂直传递。此外，病毒还能在环境及寄主种群中积累，并可通过外界环境刺激或诱发等多种途径在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口密度，是引起昆虫种群数量变动的主要因素。同时，因为它是生态系统中固有的生态因子，能够从生态系统的内部出发，通过调节内部生态因子，逐步建立起比较稳定的植物-害虫-天敌等食物链关系来实现整个生态系统的和谐与稳定，从而降低害虫连续爆发成灾的风险，实现对害虫的持久有效控制。美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)是一种对美国白蛾非常有效的病毒杀虫剂。其杀虫效果、防治方法、以及病毒生产复制方法等，国内外已有很多报道。如丹东动植物检疫所于1983-1985年，使用美国白蛾核型多角体病毒在辽宁省丹东市防治美国白蛾。武汉大学于1985年在陕西生产美国白蛾病毒，并采用病毒与Bt、敌百虫和除虫菊酯混合防治美国白蛾。1985年中国林科院何介田等从自然界分离得到了美国白蛾核型多角体病毒，经人工接种试验对各龄幼虫都有很强的感染力。在国外关于美国白蛾以及HcNPV病毒的研究很多，如美国、南斯拉夫、原捷克斯洛伐克、保加利亚、原苏联、日本、朝鲜等。而且国内外对舞毒蛾病毒、松毛虫病毒、春尺蠖病毒增效剂的研究颇多，并取得一定成果。对美国白蛾病毒辅助杀虫剂的研究提供了重要基础信息和技术支持。目前美国白蛾核型多角体病毒以在美国白蛾幼虫体内复制最为经济，而且美国白蛾人工饲养已完全解决，可以实现美国白蛾核型多角体病毒室内人工规模化扩繁。在室内条件下，美国白蛾饲养密度、饲养容器以及接毒龄期、接毒浓度对美国白蛾的生长、发育、存活以及病毒复制量等有着决定的影响。因此，本研究对美国白蛾饲养密度、饲养容器以及病毒复制最佳幼虫龄期、接毒浓度等进行了试验筛选。通过这些试验完善了美国白蛾核型多角体病毒工厂化生产流程与方法，扩大了美国白蛾病毒产量。
发明内容
本发明涉及一种美国白蛾病毒的生产工艺，在一容器中放入4龄美国白蛾幼虫，将浓度为I. OX 107PIB/ml的美国白蛾病毒液施予饲料上，用上述带有病毒的饲料来饲养上述容器中的美国白蛾幼虫使其感染，收集感毒虫或死亡虫，粉碎、过滤，将滤液离心后收集沉淀。优选的，本发明中的美国白蛾病毒为美国白蛾核型多角体病毒。优选的，所述容器杯底直径4. 5cm,杯口直径7cm，高8. 5cm,优选透明塑料杯。优选的，本发明涉及一种美国白蛾病毒的生产工艺，包括I、美国白蛾病毒的扩增
美国白蛾幼虫发育3龄末4龄初时，用消毒的无菌水配制浓度为1.0X107PIB/ml美国白蛾病毒液，优选加入氯霉素滴眼液(优选每500ml病毒液中加I管氯霉素滴眼液)。将配制好的病毒液均匀施予饲料表面，晾干(优选饲料表面无水珠，且无干裂不会过干脱离杯壁)，让幼虫取食感染。优选复制室条件为T=25°C，L:D=14:10。至接毒第5d时，优选将每养虫杯内的虫粪清除一遍,防止虫体感染杂菌。2、感毒虫的收集在幼虫接毒后至80%虫体死亡时(约接毒的第10d)，将每养虫杯内的虫粪清除干净，再将每杯的虫尸收集。3、病毒的提取将收集的病死虫尸加无菌水稀释(优选加入I倍无菌水)，搅碎(例如用绞肉机)，过滤，将滤液离心后收集沉淀。优选的，在离心之前，加水稀释滤渣(优选加入I倍的水)，过滤，将两次的滤液混合。其中过滤优选使用80目筛子。根据本发明，所述饲料可以为人工饲料。根据本发明，所述人工饲料包括韦氏盐4-15重量份、麦胚80-180重量份、干酪素30-90重量份、鹿糖5-15重量份、抗坏血酸4-15重量份、氯化胆碱O. 3_6重量份、肌醇O. 3-6重量份、胆固醇O. 5-6重量份。优选地，进一步包括琼脂8-25重量份、水适量。更优选地，所述饲料还包括山梨酸O. 3-6重量份。更优选的，本发明的人工饲料包括韦氏盐6-10重量份、麦胚100-140重量份、干酪素35-70重量份、蔗糖8-13重量份、抗坏血酸6-10重量份、氯化胆碱O. 5-4重量份、肌醇
O.5-4重量份、胆固醇1-5重量份。优选地，进一步包括琼脂10-20重量份、水适量。更优选地，所述饲料还包括山梨酸O. 5-4重量份。特别优选的，本发明的人工饲料中的组分及其重量份为韦氏盐8重量份、麦胚120重量份、干酪素50重量份、鹿糖10重量份、抗坏血酸8重量份、氯化胆碱2重量份、肌醇2重量份、胆固醇3重量份。优选地，进一步包括琼脂15重量份、水780重量份。更优选地，所述饲料还包括山梨酸2重量份。根据本发明，所述人工饲料可以为干酪素35g、韦氏盐10g、蔗糖12g、果糖23g、麦胚60g、氯化胆碱lg、对轻I. 5g、琼脂25g、金霉素O. 3g、抗坏血酸4g、4M KOH 5ml、38%甲醒
O.5ml、55%亚麻酸4. 3ml、混合维生素IOml (烟酸100g、泛酸|丐100g、核黄素50g、盐酸硫胺素25g、盐酸吡哆醇25g、叶酸25g、生物素2g、B120. 2g)、水860ml ;或者
饲料干酪素40g、蔗糖30g、韦氏盐10g、山梨酸2g、麦胚100g、琼脂16g、对羟lg、混合维生素IOg (抗坏血酸280g、氯化胆碱55g、叶酸250ml、肌醇20g、烟酸lg、卩比卩多辛230mg、胆固醇50g、B121. 5g)、水800ml。本发明进一步涉及一种人工饲养美国白蛾的方法，其中使用一特定的容器进行饲养，优选杯底直径4. 5cm,杯口直径7cm,高8. 5cm,优选使用透明塑料杯。优选的，在该容器的饲养密度为8头/杯。本发明中饲养容器不宜太大，因为饲养容器太大，在更换饲料时 有不少幼虫逃逸或被遗漏。并且较大的容器中幼虫数量多，需要的饲料也多，使得容器中湿度很大，幼虫容易感染病毒或真菌。因此容器优选透明塑料杯，杯底直径4. 5cm，杯口直径7cm，高8. 5cm。本发明中饲养密度不宜过高和过低，密度过高幼虫对食物竞争激烈，化蛹时间早，导致蛹重较小。并且化蛹时相互拥挤致使一些幼虫在预蛹期死亡。密度很小时对幼虫的体重增长也不利，其原因可能与美国白蛾低龄时群聚的习性有关。优选饲养密度为8头/杯时的饲养效果最好，不但幼虫存活率最高，幼虫和蛹的体重增长最多，而且蛹羽化率、总产卵量、单雌产卵量以及产生后代个数也最高。本发明中饲毒时的虫龄和HcNPV浓度是影响美国白蛾取食(排泄)和体重的主要因素。而且饲毒龄期以及饲毒浓度均是影响HcNPV室内增殖的重要因子。其中饲毒龄期越小，体重增加速率越慢，虫尸重也越小，从而影响最终的病毒获得量。但龄期若太高，会有绝大部分个体发育至蛹期，不发生死亡现象，最终也影响病毒的产量。优选的饲毒龄期为4龄幼虫。同饲毒龄期一样，饲毒浓度对美国白蛾幼虫虫尸重以及含毒量也存在一定影响。饲毒浓度过高，抑制幼虫的体重增长，虫尸重也低。饲毒浓度若过低，部分虫体不发生死亡，故虫体内病毒含量少。优选的饲毒浓度为I. OX 107PIB/ml。优选每500ml病毒液中加I管氯霉素滴眼液。
图I不同密度下幼虫体重增长情况。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。任何对本发明做出的改进和变化都在本发明的保护范围之内。美国白蛾2006年6月采自北京市大兴区苗圃地，室内续代饲养；美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)原液北京市西山试验林场生防中心实验室保存。HcNPV母液的制备利用无菌水将上述实验室保存的HcNPV原液配成浓度为I. 0X109PIB/ml 的母液。实施例I :美国白蛾核型多角体病毒的生产工艺I、美国白蛾病毒的扩增美国白蛾幼虫发育3龄末4龄初时，用消毒过放凉的无菌水配制浓度为I. O X 107PIB/ml美国白蛾核型多角体病毒液，且每500ml病毒液中加I管氯霉素滴眼液。将配制好的病毒液均匀涂于人工饲料(例如前述任一种，或者韦氏盐8重量份、麦胚120重量份、干酪素50重量份、蔗糖10重量份、抗坏血酸8重量份、氯化胆碱2重量份、肌醇2重量份、胆固醇3重量份。)表面，在病毒室内晾干，保证饲料和杯壁表面无水珠，且饲料无干裂不会过干脱离杯壁，每杯放入8头幼虫，让其取食感染，复制室条件为T=25°C，L:D=14:10。至接毒第5d时，将每养虫杯内的虫粪清除一遍，防止虫体感染杂菌。2、感毒虫的收集在幼虫接毒后至80%虫体死亡时(约接毒的第10d)，将每养虫杯内的虫粪清除干净，再将每杯的虫尸收集于塑料桶内，放于-5°C条件下保存备用。3、病毒提取、浓缩将收集的病死虫尸加I倍无菌水稀释，用绞肉机进行搅碎，然后再用80目筛子过 滤。然后再加I倍的水稀释滤渣，80目筛过滤。将两次的滤液混合均匀，装桶备用。4、病毒多角体含量的测定称取美国白蛾毒尸30g，加入50ml蒸馏水，放入组织捣碎匀浆机中打匀成浆，并用三层纱布过滤，将滤液倒入50ml的离心管中，4000r/min离心IOmin去上清液,沉淀加入30ml蒸馏水轻轻摇动，直至离心管底部仅剩黑色沉淀为止，将液体倒入到新的离心管中进行二次离心，离心完成后倒掉上清液，留下的沉淀加入20ml蒸馏水轻轻摇动，直至离心管底部仅剩黑色沉淀为止，将液体倒入到新的离心管中。取Iml提取液稀释10倍，连续稀释3次。取Iml稀释液滴于血球计数板上，在光学显微镜10倍镜头下先寻找血球计数板的方格条，然后在40倍镜头下沿血球计数板方格对角线进行病毒颗立体计数，其中在血球计数板每一小方格线上的病毒颗立体，按固定的两条边线进行计数，重复测定4次。病毒多角体含量=4次病毒颗粒体计数之和+80X4. OX IO6X 1000，单位PIB/ml。实施例2 :饲养容器、饲养密度、饲毒龄期、饲毒浓度的影响分析I.实验I. I饲养容器对美国白蛾生长发育及存活的影响饲养容器①透明塑料杯，杯底直径4. 5cm，杯口直径7cm，高8. 5cm。②透明塑料方盒，边长9cm,高4cm。③透明塑料带分隔方盒I,长21. 2cm,宽13. 9cm,高8cm。④透明塑料带分隔方盒2,长28. 4cm,宽19cm,高9cm。⑤透明塑料带分隔方盒3,长38. 3cm,宽25. Icm,高11cm。(注其中饲养容器③ ⑤利用硬纸壳将其分隔为3. 5X3. 5cm的小空格。)选取刚蜕皮的3龄幼虫，在容器① ⑤中(其中③ ⑤为每一空格中)置入8头幼虫，置于室内条件下饲养。室内平均温度25. (TC，RH = 60%。每24小时更换一次新鲜树叶，并观察记录一次幼虫死亡和蜕皮情况，直至化蛹，不同处理重复20次。将蛹置于养虫笼中，待其羽化后记录羽化率、产卵量以及卵的孵化情况。分析不同饲养容器对美国白蛾幼虫生长发育、存活以及成虫和卵等的影响。I. 2饲养密度对美国白蛾生长发育及存活的影响选取刚蜕皮的3龄幼虫，按不同密度分别放于容器①中(密度分别为4、6、8、10、12头/杯)，用新鲜杨树叶置于室内条件下饲养。室内平均温度25. (TC,RH = 60%。每24h更换一次新鲜树叶,并观察记录一次幼虫蜕皮情况、死亡情况、失踪情况以及体重,直至化蛹，不同处理重复20次。将蛹置于养虫笼中，待其羽化后记录雌雄性比、单雌产卵量以及卵的最终孵化率。分析不同容器对美国白蛾幼虫体重、存活以及对美国白蛾生物学特性等的影响。I. 3饲毒浓度对美国白蛾排泄以及死亡率的影响
将HcNPV 母液分别稀释 1.0X I O4、1.0X ΙΟ5、1.0X ΙΟ6、1.0X IO7 和 I. O X 108PIB/ml后，放入有新鲜人工饲料的养虫杯内，2s后倒出，阴干饲料待用。然后选取体重相当的美国白蛾2龄幼虫,单头放于带盖养虫杯(底Φ=4· 5cm,顶Φ=7· 0cm, H = 8. 5cm)中，分别饲喂上述浸过HcNPV的阴干饲料，置于室内条件下饲养。室内平均温度25. (TC，RH = 60%。每24小时记录一次虫粪重，并更换新鲜浸毒饲料，直至完全死亡或化蛹，不同处理重复50次。以浸清水的人工饲料喂饲2龄初幼虫为CK。统计分析饲毒浓度对美国白蛾排泄和死亡率的影响。I. 4饲毒龄期对美国白蛾排泄和死亡率的影响将I. O X 107PIB/mlHcNPV放带有新鲜人工饲料的养虫杯(底Φ =4. 5cm，顶Φ=7. 0cm, H = 8. 5cm)中浸2s，取出，阴干饲料。然后分别选取体重相当的美国白蛾2、3、4和5龄幼虫，单头放于带盖养虫杯中，置于室内条件下饲养。室内平均温度25. (TC,RH =60%。每24小时记录一次虫粪重和死亡情况，并更换新鲜浸毒叶片，直至完全死亡或化蛹。不同处理重复50次，以浸清水的饲料喂饲2 5龄幼虫为CK。统计分析饲毒龄期对其排泄 和死亡率的影响。I. 5饲毒龄期对美国白蛾体重影响以及虫尸重与病毒含量关系分析将I. O X 107PIB/mlHcNPV放带有新鲜人工饲料的养虫杯(底Φ =4. 5cm,顶Φ=7. 0cm, H = 8. 5cm)中浸2s，取出，阴干饲料。然后分别选取体重相当的美国白蛾2、3、4和5龄幼虫，单头放于上述带盖养虫杯中，置于室内条件下饲养。室内平均温度25. (TC，RH = 60%。每24小时记录一次幼虫体重，并更换新鲜浸毒叶片，直至完全死亡或化蛹，并分别收集死亡虫尸，称重后测病毒核型多角体含量。不同处理重复50次，以浸清水的饲料喂饲2 5龄幼虫为CK。统计分析饲毒龄期对其体重的影响以及虫尸重与病毒含量之间的关系。I. 6饲毒浓度对美国白蛾体重影响以及虫尸重与病毒含量关系分析上述HcNPV母液分别稀释 I. 0Χ104、1· 0Χ105、1· 0Χ106、1· O X IO7 和 I. OXlO8PIB/ml后，放入有新鲜人工饲料的养虫杯内，2s后倒出，阴干饲料待用。然后选取体重相当的美国白蛾初孵4龄幼虫,单头放于带盖养虫杯(底Φ=4· 5cm,顶Φ=7· 0cm, H = 8. 5cm)中，置于室内条件下饲养。室内平均温度25. (TC，RH = 60%。每24小时记录一次体重，并更换新鲜浸毒叶片，持续10天(80%个体死亡)，不同处理重复50次。分别收集所有虫体，称重后测病毒核型多角体含量，统计分析饲毒浓度对其体重的影响以及虫尸重和病毒含量之间的关系。I. 7美国白蛾核型多角体病毒含量测定收取I. 5和I. 6中刚死亡的幼虫虫尸，分别称重后加蒸馏水至200mL，用组织匀浆器IOOOOrpm勻衆9min后稀释至500倍,然后IOOOrpm离心20min,取上清液按最初病毒尸体重量稀释成2000倍液体(W/V)，镜检测定美国白蛾核型多角体病毒浓度。I. 9数据分析应用SPAS软件对上述试验相关数据进行单因素方差分析。美国白蛾致死中时LT5tl的计算方法为，将死亡时间(d)作为自变量X，死亡率作为因变量y，进行线性回归分析。然后计算出y=0. 5时X的值，即为致死中时LT5(i。2.结果与分析
2. I饲养容器对美国白蛾生长发育及存活的影响表I不同容器饲养美国白蛾生长发育和存活的影响
权利要求
1.一种美国白蛾病毒扩增的生产方法，在一容器中放入4龄美国白蛾幼虫，将浓度为1.0X107PIB/ml的美国白蛾病毒液施予饲料上，用上述带有病毒的饲料来饲养上述容器中的美国白蛾幼虫使其感染，收集感毒虫或死亡虫，粉碎、过滤，将滤液离心后收集沉淀。
2.根据权利要求I所述的生产方法，其特征在于，美国白蛾病毒为美国白蛾核型多角体病毒。
3.根据权利要求I所述的生产方法，其特征在于，其中所述的容器杯底直径4.5cm，杯口直径 7cm,高 8. 5cm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的生产方法，其特征在于，包括如下步骤 1)、美国白蛾病毒的扩增 美国白蛾幼虫发育3龄末4龄初时，用消毒的无菌水配制浓度为I. OX 107PIB/ml美国白蛾病毒液，将配制好的病毒液均匀施予饲料(例如人工饲料)表面，晾干(优选饲料表面无水珠，且无干裂不会过干脱离杯壁)，让幼虫取食感染； 2)、感毒虫的收集 在幼虫接毒后至80%虫体死亡时(约接毒的第10d)，将每杯的虫尸收集。
3)、病毒的提取 将收集的病死虫尸加无菌水稀释(优选加入I倍无菌水)，搅碎(例如用绞肉机)，过滤，将滤液离心后收集沉淀，优选的，在离心之前，加水稀释滤渣(优选加入I倍的水)，过滤，将两次的滤液混合，其中过滤优选使用80目筛子。
5.根据权利要求1-4任一项所述的生产方法，其特征在于，所述美国白蛾病毒液中加入氯霉素滴眼液，优选每500ml病毒液中加I管。
6.根据权利要求1-5任一项所述的生产方法，其中所使用的4龄美国白蛾幼虫是在一特定的容器中进行饲养的，所述容器的杯底直径4. 5cm,杯口直径7cm,高8. 5cm。
7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，其中美国白蛾幼虫的饲养密度为8头/杯。
全文摘要
本发明提供一种美国白蛾核型多角体病毒的生产工艺，其中对美国白蛾饲养密度、饲养容器以及病毒复制最佳幼虫龄期、接毒浓度等进行了改进。通过这些改进完善了美国白蛾核型多角体病毒工厂化生产流程与方法，扩大了美国白蛾病毒产量。
文档编号C12N7/00GK102965346SQ201210480369
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者梁洪柱, 陈倩, 田会鹏, 梁晓梅 申请人:北京市西山试验林场