水稻新生组织特异启动子p-EMA1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻新生组织特异启动子p-EMA1及其应用。本发明提供的启动子，来源于普通野生稻（O.rufipogon?Griff.），为如下1）或2）或3）或4）：1）序列1自5’末端第1至1841位核苷酸所示的DNA分子；2）序列1所示的DNA分子；3）与1）或2）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。本发明对于水稻早熟分子机制的研究，水稻早熟品种的选育具有重要的理论及实际意义。本发明对于水稻新生组织特异表达的分子机制的研究，以及水稻新生组织特异表达特征分子育种具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
【专利说明】水稻新生组织特异启动子P-EMA1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水稻新生组织特异启动子P-EMAl及其应用。
【背景技术】
[0002]植物新生组织(器官)均由原基分化发育而成，并且植物具有持续发育新生组织(器官)的能力，因此新生组织的生长发育状况对于整个植株的生长发育至关重要。
[0003]水稻是世界上最重要的粮食作物之一，其种子可供人类食用。水稻籽粒产量的决定因素主要包括有效穗、结实率、每穗粒数和粒重，而有效穗数和每穗粒数均于新生组织的生长状态紧密相关。因此，设计水稻新生组织特异表达的启动子对于水稻产量分子育种至关重要。
[0004]普通野生稻是亚洲栽培稻的祖先种，野生稻在演化成栽培稻的过程中，经过自然选择和人工选择，基因多样性降低，等位基因数减少。据统计，栽培稻的等位基因数约为野生稻的60%,从而导致当前水稻品种选育所面临的遗传瓶颈(geneticbottleneck)问题。因此从水稻的近缘野生种(普通野生稻Oryza rufipogon Griff.)基因组中发掘和利用在栽培稻中已丢失或削弱的优异基因，并把它们应用于水稻育种生产中具有十分重要的理论意义和实践价值，也是解决当前水稻育种难题的一条行之有效的途径。
[0005]我国野生稻资源丰富，从野生稻中发掘、定位、克隆水稻新生组织特异启动子，将对水稻生产具有重要意义。[0006]云南元江普通野生稻是中国生长位置海拔最高(780m)的普通野生稻，其生长环境与栽培稻的隔离条件好，没有栽培稻基因的渗入。Sun等(2002)对元江普通野生稻核基因组及线粒体、叶绿体基因组的遗传分化的研究表明，元江普通野生稻是一个非常特殊的普通野生稻群体，是研究亚洲野生稻起源演化和拓宽水稻遗传基础的重要材料。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种水稻新生组织特异启动子P-EMAl及其应用。
[0008]本发明提供了一种具有启动子功能的DNA片段，命名为P-EMAl (或ρ_ΕΜΑ1)，来源于普通野生稻(0.rufipogon Griff.),为如下I)或2)或3)或4):
[0009]I)序列表中序列I自5’末端第I至1841位核苷酸所示的DNA分子；
[0010]2)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0011]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
[0012]4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
[0013]上述严格条件可为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0014]含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。[0015]所述重组载体可为在植物表达载体pCambial381的多克隆位点插入所述DNA片段得到重组质粒。所述重组载体具体可为将所述DNA片段插入植物表达载体pCambial381的BamHI和HindIII酶切识别位点间得到的重组质粒。
[0016]扩增所述DNA片段的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0017]本发明还保护所述DNA片段在启动目的基因表达中的应用。所述启动目的基因表达可为启动目的基因的特异性表达。所述特异性表达具体可为组织特异表达。所述组织特异表达可为新生组织特异表达。所述新生组织为幼芽(特别是幼芽基部)、根的生长点，新生叶或新生穗。
[0018]本发明还保护所述DNA片段在培育转基因植物中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，如水稻品种“日本晴”。
[0019]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是在出发植物中用所述DNA片段启动目的基因的表达，得到表达所述目的基因的转基因植物。所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，如水稻品种“日本晴”。所述目的基因具体可为GUS基因。所述方法具体可为将所述重组载体导入所述出发植物，从而在所述出发植物中用所述DNA片段启动⑶S基因的表达。
[0020]本发明公开了一个水稻新生组织特异启动子P-EMAl及其应用。本发明提供的DNA片段具有启动子的功能，具有特异表达的特性。本发明对于水稻早熟分子机制的研究，水稻早熟品种的选育具有重要的理论及实际意义。本发明对于水稻新生组织特异表达的分子机制的研究，以及水稻新生组织特异表达特征分子育种具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。 【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为目的片段在渗入系YIL23和特青不同生长发育时期的表达谱分析。
[0022]图2A为融合⑶S基因载体不意图。
[0023]图2B为P-EMAl的PCR扩增策略。
[0024]图3为转基因植株⑶S组织染色结果；a为5d幼苗；b为15天苗的幼叶；c_i为穗发育不同时期的染色结果。
【具体实施方式】
[0025]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任公司完成。
[0026]水稻品种“日本晴”:中国作物种质资源信息网(http://icgr.caas.net.cn/),库编号为I1A13071。
[0027]水稻品种“特青”:中国作物种质资源信息网(http://icRr.caas.net, cn/),库编号为 I1A40810。
[0028]植物表达载体pCambial381 即 NCBI 中的 Binary vector pCAMBIA-1381,为环形质粒，其核苷酸序列见NCBI中的如下序列:GenBank:AF234302.1 ;VERSION:AF234302.1 ；G1:7638091 ο植物表达载体pCambial381的核苷酸序列中，第9810至10590位核苷酸为CaMV35S启动子(组成型启动子)，用来启动潮霉素基因；第2-1855位核苷酸为GUS基因(质粒中没有用于启动GUS基因的启动子)；第7214-8008位核苷酸为aadA基因(卡那霉素抗性基因)；第8749-9774位核苷酸为hptll基因(潮霉素抗性基因)。
[0029]实施例1、水稻新生组织特异启动子P-EMAl的发现
[0030]一、EMAl基因的发现
[0031]从以云南元江普通野生稻(Orzya rufipogon Griff.)为供体亲本和籼稻品种特青(Oryza sativa ssp.1ndica)为受体亲本构建的渗入系群体中分离了一个早熟渗入系HL23，比特青提前约28天抽穗，通过图位克隆的策略克隆了该早熟基因EMA1。分析双亲EMAl基因的表达显示，苗期EMAl基因在叶中的表达量逐渐升高，到顶点后迅速降低，但EMAl基因在渗入系HL23中表达量升高的速度比在特青中要快(见图1，TQ代表特青，YIL23代表早熟渗入系YIL23)。即在苗期，渗入系YIL23中EMAl的表达比特青中EMAl的表达更强，且随着幼苗长大，双亲中EMAl的表达量逐渐升高。
[0032]二、水稻新生组织特异启动子P-EMAI的发现
[0033]由于候选基因EMAl的第I内含子长约30kb，因此无法直接从基因组序列扩增目的基因。我们采取如下策略进行扩增(见图2B):(1)用P1/P2引物从YIL23的基因组DNA扩增片段1，该片段包含EMAl的启动子区域(约ATG上游2kb)、5’UTR和第I外显子的部分序列。其中，P2引物位于第I外显子；(2)以P3/P4引物从HL23的第I链cDNA扩增片段2，该片段包含EMAl ORF的大部分序列和3’UTR的部分序列。其中，P3引物与P2引物反向互补；(3)将扩增的片段I和片段2混合，加入除引物外的PCR反应组分进行如下程序:预变性95° C 5分钟；变性95° C I分钟，退火55° C I分钟，延伸72° C I分钟，循环5次；过度延伸7分钟；然后加入`引物P1/P4进行正常的PCR扩增获得片段3，该片段包含EMAl的启动子区域、5’ UTR和ORF序列。其中，Pl和P4引物的5’端分别含有内切酶BamHI和HindIII的识别位点。将PCR产物进行测序，测序结果表明，PCR产物具有序列表的序列I所示的DNA片段。
[0034]将序列表的序列I所示的DNA片段命名为P-EMAl (新生组织特异启动子)(序列I中，第I至1841位核苷酸为预测的启动子序列，余下的核苷酸为CDNA序列)。
[0035]实施例2、P-EMAl转基因水稻的获得及其鉴定
[0036]一、植物表达载体的构建
[0037]1、合成序列表的序列I所示的双链DNA分子。
[0038]2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用Pl和P4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0039]Pl:5，-ATGGATCC ATCACCGCAAATACTCTCCC-3，；
[0040]P4:5，-GCAAGCTT ACGCAGAGATCCAGCTTATTCC-3，。
[0041 ] Pl中，带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点；
[0042]P4中，带下划线碱基为限制性内切酶HindIII的识别位点。
[0043]3、用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0044]3、用限制性内切酶BamHI和Hindi 11双酶切植物表达载体pCambial381，回收载体骨架(约 10650bp)。
[0045]4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pCambial381-pEMAlo根据测序结果,对重组质粒pCambial381_pEMAl进行结构描述如下:在植物表达载体pCambial381的BamHI和HindIII酶切位点之间插入了序列表的序列I所示的DNA片段。
[0046]二、pCambial381_pEMAl 转基因水稻的获得
[0047]1、将水稻品种“日本晴”的成熟胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒pCambial381-pEMAl轰击到愈伤组织,具体步骤如下:
[0048](I)将水稻品种“日本晴”的成熟胚愈伤组织在高渗透培养基(NB培养基+91.2g/L甘露醇)上进行渗透处理4-6h (28°C，暗培养)。
[0049](2)用重组质粒 pCambial381_pEMAl 包裹直径 110 μ m 金粉，采用 PDS-1000/He 基因枪(Bio-Red公司生产)，选择IlOOPsi的可裂膜，载样距靶材料6cm进行轰击。
[0050](3)轰击后的愈伤组织继续在原培养基上培养16h (28°C，暗培养)。[0051]2、将完成步骤I的愈伤组织转移到恢复培养基(NB培养基+2mg/L 2，4_D)上，恢复培养I周(28°C，暗培养)。
[0052]3、将完成步骤2的愈伤组织转移到筛选培养基(NB培养基+50mg/L潮霉素)上，28°C暗培养30天。
[0053]4、将完成步骤3的愈伤组织转移到筛选培养基(NB培养基+50mg/L潮霉素)上，28°C暗培养30天。
[0054]5、将步骤4得到的愈伤组织转移到预分化培养基上(NB培养基+5mg/L脱落酸+50mg/L潮霉素+2mg/L萘乙酸+lmg/L 6-节氨基嘌呤),28?暗培养15天。
[0055]6、将步骤5得到的愈伤转到分化培养基上(NB培养基+2mg/L 6_苄氨基嘌呤+lmg/L萘乙酸+lmg/L激动素+50mg/L潮霉素),28°C光照培养15天。
[0056]7、将步骤6中幼苗转移到生根培养基上(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸+0.09g/L肌醇+30g/L蔗糖)，28°C光照培养30天。
[0057]8、将步骤7中苗高7-8cm且根系发达的植株移栽到花盆，放置于温室中培养3周，成活的植株即为Ttl代植株。Ttl代植株自交产生的种子及由它所长成的植株用T1代表示。
[0058]9、将Ttl代植株进行PCR鉴定(靶序列为潮霉素抗性基因，引物对由IF和IR组成，靶序列约为lOOObp)，PCR鉴定为阳性的植株即为转基因植株。
[0059]IF:5，-tacttctaca cagccatc-3，；
[0060]IR，5， -cgtctgtcga gaagtttc-3，。
[0061]三、转空载体植株的获得
[0062]将植物表达载体pCambial381代替重组质粒pCambial381_pEMAl进行步骤二的操作，得到转空载体植株。
[0063]四、转基因水稻的组织表达特异性分析
[0064]取步骤二得到的转基因植株或步骤三得到的转空载体植株分别进行如下鉴定:
[0065]观察染色结果发现，正常培养T1代植株，在不同的发育阶段取转基因植株的幼苗整株、叶片和穗等进行GUS染色分析。萌发5天的幼苗的GUS染色照片见图3a，转基因幼苗中呈现了明显的⑶S染色，且多集中在幼芽基部和根的生长点等部位。观察第15天(生长15天的幼苗)幼苗的GUS染色结果见图3b，转基因幼苗在叶上能观察到比先前更为明显的GUS染色，在新生叶上尤为显著。孕穗期的照片见图3c-1，在穗发育的不同时期，转基因植株获得的小穗(新生穗)均能观察到明显的GUS染色。
[0066]因此，无论是在苗期叶片还是在进入孕穗期的穗，P-EMAl在新生组织和细胞旺盛分裂的部位(如生长点、幼穗)表达量较高。
[0067]转空载体植株在各个相应时期的各个组织部位均不具有GUS表达活性。
[0068]实施例2的实验重复进行`三次，都得到同样的结果。
【权利要求】
1.一种DNA片段，为如下I)或2)或3)或4): 1)序列表中序列I自5’末端第I至1841位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列I所不的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为在植物表达载体pCambial381的多克隆位点插入权利要求1所述DNA片段得到重组质粒。
4.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为将权利要求1所述DNA片段插入植物表达载体pCambial381的BamHI和HindIII酶切识别位点间得到的重组质粒。
5.扩增权利要求1所述DNA片段的全长或其任意片段的引物对。
6.权利要求1所述DNA片段在启动目的基因表达中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于:所述启动目的基因表达为启动目的基因特异性表达。
8.一种培育转基因植物的方法，是在出发植物中用权利要求1所述DNA片段启动目的基因的表达，得到表达所述目的基因的转基因植物。
【文档编号】C12N15/63GK103834655SQ201210482822
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月23日 优先权日:2012年11月23日
【发明者】孙传清, 谢道昕, 彭文, 谭禄宾, 叶盛, 张永生, 单晓昳, 刘凤霞 申请人:中国农业大学