专利名称：一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法
技术领域：
本发明涉及食品检验和生物技术领域，具体地说，涉及一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法。
背景技术：
食品〃掺杂使假〃 一直是消费者关注的焦点问题之一，有些不法企业和商家为了降低成本，在肉制品加工过程中以猪肉冒充牛羊肉，或以其它低价肉替代高价肉而未在标签上注明。这不仅严重侵害了消费者利益，而且如果清真食品中掺有猪肉成分还会涉及到民族和宗教等问题，造成恶劣的社会影响。此外，流行病学研究证明饲料中的动物源性成分是造成“疯牛病”等神经系统疾病传播的主要因素。目前，用于肉种成分鉴定的技术大多建立在对蛋白质结构与DNA序列特异性分析 的基本上，包括酶联免疫(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、电泳、色谱、生物传感分析等技术。其中，Taqman实时荧光PCR (Taqman PCR)法在灵敏度、准确性和重复性等重要性能参数上无可比拟的优势，成为该领域的主流技术，是作为仲裁方法和司法鉴定的理想技术类型，是现行国家和行业标准中指定的方法之一。然而，现有的研究大多集中在对饲料中猪、牛、羊等动物源性成分的定性检测上，而用于食品掺假鉴别，特别是涉及有关核酸成分定量检测技术的研究较为滞后。单纯的定性检测已不能满足需求，如在肉、奶等食品“掺杂使假”案件的处理中，如何判定掺假成分是添加还是污染所致，如何确定掺假严重程度都需要有可靠的定量技术作为依托。生物样品的复杂性，如动物种别、年龄、性别、器官、肌肉类型差别等，导致DNA提取总量和扩增靶序列模板总量差异，给标准样品的选定和制备造成困难。因此急需系统误差小、可信度高的食品掺假行为判定方法的出现。
发明内容
本发明目的是提供一种牛特异性引物和探针，用于检测肉及肉制品中牛源性成分。本发明再一目的是提供含有上述引物的试剂盒。本发明又一目的是提供一种检测试样中牛源性成分含量的方法，用于量化判定待测牛肉产品中牛肉纯度，是否存在掺假行为和掺假情况的严重程度。本发明所述牛特异性引物是根据牛线粒体DNA中NADH脱氢酶4亚基基因上牛特异性碱基序列设计而成，其核苷酸序列为上游引物为5’-AATATAAITTGGGTTAACTCCACAGC-3’ ；下游引物为5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’ ；并设计了与上述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为5’ -F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’;其中，F 为荧光报告基团，M 为荧
光淬灭基团。
优选地，F为 FAM ;M 为 TAMRA。为实现本发明目的，本发明还提供一种脊椎动物通用引物和探针，其是根据脊椎动物线粒体DNA (16s rDNA)上的保守序列设计，上游引物为5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’ ；下游引物为5，-AGATAGAAACCGACCTG GAT-3’；探针为
5’-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’(用于单重 PCR)或5’ -HEX-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’(用于双重 PCR)。本发明进一步提供一种利用上述引物和探针通过单重PCR测定样品中牛肉成分占总肉成百分比含量的方法，具体包括以下步骤I)制备待测样品匀浆，提取DNA。2)提取纯牛肉DNA，稀释至至少5个浓度梯度作为标准品，制作标准曲线，浓度跨度范围可根据实际需求调整，提取过程与I)同步，或事先制备好。3)单重PCR，采用上述牛特异性引物和探针，通用引物和探针(F为FAM)对步骤I)和2)获得的DNA模板，在I个PCR板上的不同反应管同时进行PCR扩增，按照表I进行加样，PCR过程在I个通道收集荧光信号；然后按照公式I计算出待测样品中牛源性成分的百
分含量。表I单重PCR 96孔板加样方案
权利要求
1.一种检测肉及肉制品中牛源性成分的牛特异性引物，其特征在于，上游引物为5’ -AATATAAITTGGGTTAACTCCACAGC-3’ ；下游引物为5’ -GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’。
2.含有权利要求1所述引物的试剂盒。
3.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，其核苷酸序列为5’ -F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’;其中，F 为荧光报告基团，M 为荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括脊椎动物通用引物和探针，上游引物为5’ -TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’ ；下游引物为5’ -AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’ ；所述探针为5’ -F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3’，其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团；优选F为FAM或HEX ；M为TAMRA。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、 PCR反应缓冲液、纯牛肉DNA标准品中的一种或几种。
7.—种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法，其特征在于，1)待测样品匀浆，提取DNA;2)提取纯牛肉DNA，进行浓度梯度稀释，制作标准品；3)分别以步骤I)和步骤2)中提取的DNA为模板，用权利要求1所述的引物、权利要求3所述的探针和权利要求5所述的通用引物和探针进行PCR扩增，以纯牛肉标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算待测样品中牛源性成分的百分含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR为单重PCR，其中10μ I反应体系包含
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为95°C变性 10-15秒，58-62 °C退火+延伸45-60秒，35个循环。
10.权利要求1所述引物、权利要求2或5-6任一项所述试剂盒在检测牛肉及其制品掺假中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法。该方法包括一对牛特异性引物，上游引物为5’-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3’；下游引物为5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’；及与其配合使用的探针5’-F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’，以及包含所述引物和探针的试剂盒。本发明方法最大程度地降低了定量误差，具有较高的准确性和抗干扰能力，能够准确、便捷的检出牛肉及其制品中牛源性分占总肉成分的百分比含量。本发明提供了单重和双重两种PCR模式，分别适用于不同的需求。
文档编号C12Q1/68GK102994637SQ201210487438
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者李家鹏, 周彤, 田寒友, 杨君娜, 邹浩, 乔晓玲, 陈文华, 曲超 申请人:中国肉类食品综合研究中心