一种与肝癌易感性相关的单核苷酸多态性位点rs9275319及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术的基因领域，涉及与肝癌易感性相关的单核苷酸多态性位点（SNP）及其应用。本发明提供了遗传区域6p21.3的基因部分序列（序列如SEQ.ID.NO.1所示）及其中一个SNP位点rs9275319（序列如SEQ.ID.NO.2所示）。本发明还提供了检测该SNP位点的方法，序列如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示的特异性核酸引物，及序列如SEQ.ID.NO.5所示的UEP引物。本发明还涉及SNP位点rs9275319的检测试剂盒及其应用。本发明能够对rs9275319位点进行基因分型，方法简便、快速，结果准确、明了，为肝癌易感性鉴定以及预防和治疗提供了一个新的途径。
【专利说明】—种与肝癌易感性相关的单核苷酸多态性位点rs9275319
及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术的基因领域，具体涉及一个与肝癌易感性相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点及其应用。
【背景技术】
[0002]肝癌是世界上第七大常见恶性肿瘤，在癌症相关死因中位于第三位(YangJD, Roberts LR.Hepatocel lular carcinoma:A global view.Nat Rev GastroenterolHepatol.2010;7:448-58.)，全球每年预计新发病例74.83万人，病死例数约69.59万人，其中半数以上的肝癌病例都集中在中国(Jemal A, Bray F，Center MM, Ferlay J, WardE, Forman D.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin.2011;61:69-90.X
[0003]在世界范围内，慢性乙肝和慢性丙肝是肝癌的主要风险因子，几乎80%的肝癌病人均有乙肝或丙肝病史，54%的肝癌病人其患癌的原因是乙肝病毒的感染；但是在中国，超过80%的肝癌病人均有乙肝病史(Tanaka M, Katayama F，Kato H, Tanaka
H,Wang J, Qiao YL, InoueM.Hepatitis B and C virus infection and hepatocellularcarcinoma in China: a reviewof epidemiology and control measures.JEpidemiol.2011;21:401-16.)。
[0004]中国是世界上的乙肝大国，普通人群中乙肝表面抗原(HBsAg)的阳性率为高达9%，有1.2亿人曾经感染过乙肝病毒，其中有3000万人转化成为了慢性乙肝，占全世界所有乙肝病人的三分之一。患慢性乙肝五年后，有10-20%的人将发展成为肝硬化；有约6-15%的慢性乙肝和肝硬化病人会发展成为肝癌(Liu J, Fan D.Hepatitis B in China.Lancet.2007;369(9573):1582-3.)。
[0005]乙肝发展成为肝癌的风险因素有很多，其中遗传因素是乙肝发展成为肝癌的重要风险因素。研究表明，相比于没有肝癌家族史的乙肝病人而言，有肝癌家族史的乙肝病人发展成为肝癌的相对风险(relative risk, RR)是2.41,有两个以上亲属是肝癌患者的乙肝病人发展成为肝癌的RR高达5.55 (Yu MW，Chang HC, Liaw YF, Lin SM, LeeSD,Liu CJ,ChenPJ, Hsiao TJ,Lee PH,Chen CJ.Familial risk of hepatocellularcarcinoma among chronichepatitis B carriers and their relatives.J Natl CancerInst.2000;92:1159-64.)。
[0006]造成个体之间差异的遗传物质基础之一就是SNP。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的基因组变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个碱基对中就有I个，估计其总数可达300万个甚至更多(Collins FS, Brooks LD, ChakravartiA.A DNApolymorphism discovery resource for research on human genetic variation.Genome Res.1998; 8 (12): 1229-31.)。目前，SNP是研究人类常见疾病遗传变异的重要依据。但是，至今未见有本发明涉及的STAT4基因与肝癌相关联的报道，也没有关于STAT4基因上多态性位点与肝癌的相关性以及针对具体SNP的检测方法和检测试剂盒的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种与肝癌易感性相关的6p21.3区域内的基因序列，通过SNP位点rs9275319的序列研究，提出一种易感性相关的肝癌高危人群的筛查的方法，以利于预防和治疗。
[0008]本发明首先提供与肝癌易感性相关的6p21.3区域上的部分基因序列，该基因序列的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示，其第501位为G或者A。
[0009]本发明研究表明6ρ21.3区域与肝癌的6ρ21.3区域上的一个SNP位点rs9275319。rs9275319 位于基因 HLA-DQB1 与 HLA-DQA2 之间；rs9275319 碱基为 G 或者 A ；rs9275319 的核苷酸序列通过http://genome, uses, edu/数据库获得，其序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0010]本发明还提供检测一个SNP位点的特异性核酸引物:SEQ.1D.N0.3、SEQ.1D.N0.4、SEQ.1D.N0.5，且特异性地扩增出该SNP位点的扩增产物。
[0011]本发明还提供所述的与肝癌易感性相关的6p21.3遗传区域的应用，通过提取受试者基因组DNA进行SNP性位点rs9275319的基因分型，其中rs9275319碱基为A的个体为肝癌易感人群，rs9275319碱基为G的个体为肝癌非易感人群。
[0012]本发明还提供检测一个SNP位点的特异性核酸引物:SEQ.1D.N0.3、SEQ.1D.N0.4，以及UEP引物(单碱基延伸引物)SEQ.1D.N0.5，以便特异性地扩增出该SNP位点的扩增产物。
[0013]本发明还提供一种检测SNP位点rs9275319的方法，获得rs9275319序列的步骤依次为:
[0014](I)利用特异性核酸引物(SEQ.1D.N0.3、SEQ.1D.N0.4)扩增样本的DNA ；
[0015](2)取步骤(1)的产物为模板，利用UEP引物(SEQ.1D.N0.5)进行单碱基延伸；
[0016](3)质谱检测步骤(2)的产物。
[0017]其中，步骤(1)的扩增条件可以为:95°C 2min ；95 V 0.5min, 56 V 0.5min,72°C lmin, 45 个循环；72°C 5min，25°C ⑴(无限)min。
[0018]其中，步骤(1)的产物通常经过纯化后再进行单碱基延伸。
[0019]其中，步骤(2)所述的单碱基延伸的条件可以为:94 V 30s ；94 V 5s,52°C 5s-80°C 5s，内部循环 5 次，外部循环 40 次；72°C 180s ;25°C^(无限)s。
[0020]其中，获得rs9275319序列的具体步骤可以如下:
[0021]选择SNP性位点rs9275319并设计引物；
[0022]依据相应的碱基序列合成特异性核酸引物:ACGTTGGATGCCTCAAMGTAGGGAAGCTG(SEQ.1D.N0.3), ACGTTGGATGCCACCCTTCATTTTTCTCCC (SEQ.1D.N0.4)以及 UEP 引物:TCTGTGGTTGAAGGTC (SEQ.1D.N0.5) ；PCR 反应体系 5ul:0.625ul 10XTaqBuffer, 0.125mMdNTP, 0.12ull0nM PCR 引物 Mix，0.32525nM MgCl2, 0.lul5U/ML Hotstar 酶，用 ddH20 补足5ul ;PCR 反应条件:95°C 2min ；95°C 0.5min，56°C 0.5min，72°C lmin，45 个循环；72°C 5min,25 °C min ；SAP 纯化反应体系 2ul:0.17ullOXSAPBuffer, 0.31U/ul SAP 酶，用 ddH20补足2ul ；SAP纯化反应条件:37 °C 40min, 85 °C 5min, 25 °C 00 min ;单碱基延伸反应体系2ul:0.210 X iPlexBuffer, 0.2iPlex Termination, 0.33100uM 终止引物 Μ?χ,Ο.041iPlexEnzyme,用 ddH20 补足 2ul ;单碱基延伸反应条件:94 °C 30s ；94°C 5s, 52 °C 5s_8(TC 5s，内部循环5次，外部循环40次；72°C 180s ；25°C°o s ;将反应产物经树脂纯化后，取15nL，SpectroCHIP 芯片上样；通过MassARRAY? MALD1-TOF Mass Spectrometry 进行质谱检测，并获取SNP rs9275319分型数据。
[0023]本发明还提供了一种检测SNP位点rs9275319的试剂盒，所述的试剂盒包括序列如SEQ.1D.N0.3、SEQ.1D.N0.4所示的特异性核酸引物。
[0024]所述的试剂盒还包括UEP引物，其序列如SEQ.1D.N0.5所示。[0025]所述的试剂盒还可以包括PCR的缓冲液。
[0026]所述的试剂盒还可以包括标准试剂和说明书，等等。
[0027]本发明提供了上述试剂盒的应用，利用该试剂盒确定SNP位点rs9275319的序列:扩增样本的DNA ;然后进行单碱基延伸；最后质谱检测并分型。
[0028]其中，可以利用上述特异性核酸引物和UEP引物扩增样本的DNA。
[0029]实验表明，本发明可以特异、高效检测出rs9275319多态性位点。利用Taqman方法和直接测序，检测相同样本，基因分型结果相同。
[0030]本发明还提供所述的与肝癌易感性相关的6p21.3遗传区域的应用，通过提取受试者基因组DNA进行SNP性位点rs9275319的基因分型，其中rs9275319碱基为A的个体为肝癌易感人群，rs9275319碱基为G的个体为肝癌非易感人群。
[0031]本发明的优点:
[0032]I)根据本发明提供的引物序列可以特异、高效检测出rs9275319多态性位点。
[0033]2)根据本发明检测SNP位点rs9275319的基因分型结果判定肝癌易感人群的方法，可对未表现出肿瘤临床症状的乙肝病人进行筛查，来应用于对肝癌辅助诊断和对乙肝病人是否具有肝癌易感性进行评判，从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
[0034]3)位于rs9275319多态性位点附近的DNA序列还有不少SNP位点，这些信息将对判断肝癌的发生发展起到一定作用。
【具体实施方式】
[0035]以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0036]实施例1.[0037]通过提取受试者基因组DNA进行SNP位点rs9275319的基因分型，其中rs9275319碱基为A的个体为肝癌的易感人群。具体做法是:
[0038]1.基因组DNA的提取
[0039]受试者均由外周静脉血抽取2-3ml，采用QIAamp Blood MiniKit250 (QIAGEN，德国)试剂盒提取基因组DNA，-20°C保存。
[0040]2.SNP基因分型
[0041]根据SNP的序列信息，设计PCR反应和单碱基扩展引物(即UEP引物)，并在生物工程(上海)有限公司合成。合成后的引物与样品DNA进行PCR反应，混合后的反应产物在SequenomiPLEX仪器(Sequenom公司)上进行SNP基因分型。具体实验流程如下:
[0042](I)引物设计:为多重反应自动设计PCR引物(SEQ.1D.N0.3 ;SEQ.1D.N0.4)和iPLRX* Gold 单碱基延伸引物(SEQ.1D.N0.5)；
[0043](2) PCR 反应:
[0044](A) PCR反应液(Mix):按照下表中的顺序从上到下依次加入,单位:ul
【权利要求】
1.一种与肝癌易感性相关的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子包括SNP位点rs9275319，其序列如 SEQ.1D.N0.2 所示。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，该核酸分子的第27位碱基是G或者A。
3.一种与肝癌易感性相关的6p21.3区域上的基因部分序列，其特征在于，该6p21.3区域上的基因部分序列包括权利要求1所述的序列，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
4.一组检测SNP位点rs9275319的引物，其特征在于，所述的引物由特异性核酸引物和UEP引物组成，特异性核酸引物的序列如SEQ.1D.N0.3和SEQ.1D.N0.4所示，UEP引物的序列如SEQ.1D.N0.5所示。
5.一种检测SNP位点rs9275319的方法，其特征在于，获得rs9275319序列的步骤依次为: (1)利用权利要求4所述的特异性核酸引物扩增样本的DNA;所述的特异性核酸引物的序列如 SEQ.1D.N0.3 和 SEQ.1D.N0.4 所示； (2)以步骤(1)的产物为模板，利用UEP引物进行单碱基延伸，所述的UEP引物的序列如 SEQ.1D.N0.5 所示； (3)质谱检测步骤(2)的产物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)的扩增条件为:95°C2min ；95°C 0.5min, 56°C 0.5min, 72°C lmin, 45 个循环；72°C 5min, 25°C ① min。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)的产物经过纯化后再进行单碱基延伸。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的单碱基延伸的条件为:940C 30s ；94°C 5s, 52°C 5s_80°C 5s,内部循环 5 次，外部循环 40 次；72°C 180s ；25°C^ s。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，获得rs9275319序列的具体步骤如下: 选择SNP位点rs9275319并设计引物； 依据相应的碱基序列合成特异性核酸引物SEQ.1D.N0.3，SEQ.1D.N0.4以及UEP引物SEQ.1D.N0.5 ；PCR 反应体系 5ul:0.625ul 10 X TaqBuffer, 0.125mM dNTP, 0.12ull0nM PCR引物 Mix，0.32525nM MgCl2, 0.lul5U/ML Hotstar 酶，用 ddH20 补足 5ul ;PCR 反应条件:95°C 2min ；95°C 0.5min, 56°C 0.5min, 72°C lmin, 45 个循环；72°C 5min, 25°C ⑴ min ；SAP 纯化反应体系 2ul:0.17ullOXSAPBuffer, 0.31U/ul SAP 酶，用 ddH20 补足 2ul ；SAP 纯化反应条件:37°C 40min，85°C 5min, 25°C ^ min ；
单喊基延伸反应体系 2ul: 0.210 X iPlexBuffer, 0.2iPlex Termination, 0.33IOOuM终止引物Mix,0.041iPlex Enzyme,用ddH20补足2ul ;单碱基延伸反应条件:94°C 30s ；94°C 5s, 52°C 5s-80°C 5s,内部循环 5 次，外部循环 40 次；72°C 180s ；25°C^ s ； 将反应产物经树脂纯化后，取IOnL进行SpectroCHIP芯片上样；通过MassARRAY?MALD1-TOF Mass Spectrometry进行质谱检测，并获取SNP位点rs9275319的分型数据。
10.一种检测SNP位点rs9275319的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求4所述的特异性核酸引物。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括UEP引物，其序列如 SEQ.1D.N0.5 所示。
12.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括的PCR中使用的缓冲液。
13.权利要求1所述的核酸分子的应用，其特征在于，通过提取受试者基因组DNA进行SNP位点rs9275319的基因分型，rs9275319碱基为A的个体为肝癌易感人群，rs9275319碱基为G的个体为肝癌非易感人群。
14.权利要求10所述的试剂盒的应用，其特征在于，确定SNP位点rs9275319的序列:扩增样本的DNA ;然后进行单碱基延伸；最后质谱检测并分型。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，利用权利要求4所述的特异性核酸引物扩增离体样本的基因组DNA，利用UEP引物进行单碱基延伸。
【文档编号】C12N15/11GK103834639SQ201210493219
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月27日 优先权日:2012年11月27日
【发明者】余龙, 蒋德科, 徐剑锋, 马晓颦, 唐丽莎 申请人:复旦大学