专利名称：真菌葡寡糖铬络合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体提供了一种含利用真菌葡寡糖为配体化合物，以三价铬为配位中心离子制备的葡寡糖铬络合物及其制备方法。
背景技术：
铬是目前研究较多且结论较为一致的一种重要的微量元素，在糖尿病患者中该微量元素含量明显降低，究其原因，是三价铬在人体内可形成葡萄糖耐受因子(glucosetolerance factor, GTF),协同胰岛素一起参与人体糖和脂质代谢。二十世纪五十年代，Cr3+被证实是GTF的主要活性成分，八十年代被确定为人体必需微量元素。铬的生理功能主要以Cr3+的形式构成GTF协助胰岛素作用，影响糖类、脂类、蛋白质和核酸的代谢，没有铬，GTF就无活性。GTF-Cr天然存在于啤酒酵母、肌肉、胡椒、燕麦粉等物质中，动物体内的GTF-Cr可由无机铬转化而来，但转化率很低，且有的不能转化。GTF是维持动物血液中葡萄糖水平的一种物质，其作用是增加动物的葡萄糖耐受量和增强胰岛的活性进而刺激组织对葡萄糖的摄取。这种增强作用可能是GTF通过调节胰岛素与细胞膜胰岛素受体上的巯基形成二硫键，促使胰岛素发挥作用，在铬的存在下，具有小剂量的胰岛素即可发挥最大效应的生物学作用。三价铬离子是络合性能极强的中心离子，杂化后三价铬离子具有配位数6，能与有机物分子中有自由电子对的原子或基团(羧基、胺基、羰基)形成牢固的配价键，从而构成稳定的铬络合物(螯合物)，并赋予后者以高生物利用率等特殊性能。无机铬可作为食品添加剂应用的有氯化铬和硫酸铬，存在吸收率低，有效性难以发挥的缺点；有机铬吸收率比无机铬吸收率高，其有效性是无机铬的10倍以上，是一种有应用前景的铬补充物。有机铬现在主要有高铬酵母和络合铬(如烟酸铬、蛋白铬、氨基酸铬和甲基吡啶铬)等，络合铬通常是由一些能促进个吸收的物质与各组成，如烟酸、氨基酸类、吡啶羧酸，以及能与铬形成稳定络合物的物质，如蛋白质以及谷胱甘肽、葡萄糖酸等。这些具有生物活性的有机铬络合物可分为四类吡啶羧酸铬、脂肪族有机酸铬络合物、氨基酸铬和高铬酵母和其他有机铬络合物。近年来有利用多糖类物质合成的多糖铬主要有海藻多糖铬、魔芋葡甘露寡糖铬(III)络合物和黄芪多糖铬络合物。皮考啉酸和烟酸是最早被用于有机酸铬制备的有机羧酸。皮考啉酸铬的利用率为氯化铬的4倍，但其日服用安全剂量到目前尚未确定；烟酸铬不溶于水，具有不在内脏沉积的优点。但是上述的皮考啉酸和烟酸价格高，制备成本难以降低不适合大范围推广。喹啉酸分子中有两个羧酸，其铬络合物更亲水并溶于水，故更易于稀释和作为添加剂配入食品或饲料。脂肪族有机酸铬络合物包括柠檬酸铬、丙酸铬、乳酸铬和葡萄糖酸铬、氨基葡萄糖酸铬、 -3脂肪酸铬络合物。美国专利US5340834利用氯化铬合柠檬酸制备的柠檬酸铬饲喂小鸡的结果表明，能提高饲料利用率和鸡的体重。该产品水溶性较低，不利于稀释使用。
美国专利US 5707679在带水冷式回流冷凝器的反应器内，加入丙酸和二水重铬酸钠，再加入右旋糖(extrose),混合物温度迅速升到120_135°C反应约3小时。得到的丙酸铬产品不含六价铬，溶液可直接加到饲料中，或者喷到植物原料上，或者加到其他载体(碳酸钙、蛭石、膨润土等等)制成干品。但是该方法反应条件剧烈而苛刻，无法有效转化为规模化生产。中国专利CN 1104625利用硫酸铬和乳酸钙制备得到乳酸铬结晶，用此乳酸铬，与铜、锰、锌、钙的乳酸盐组成复合营养素，试用后反映良好，能调节人体微量元素的平衡，增进食欲，增强机体抗病能力，抗癌、防癌、防治动脉粥样硬化，对高血压、血脂、胆固醇，起到营养治病作用。中国专利CN 1162590制得的葡萄糖酸铬对小白鼠进行喂食及腹腔注射实验，证明无毒，具有降糖、降脂作用，能减轻尿糖症状，中国专利CN 1472217利用氨基葡萄糖酸制备了氨基葡萄糖酸铬，证明在铬浓度相同的条件下，氨基葡萄糖酸铬的调节血糖的能力优于吡啶甲酸铬，高剂量时还可降低小鼠0. 5小时餐后血糖浓度。世界专利WO 2006109194利用《 _3脂肪酸和三价铬有类似作用的特点，将两者化合成新的络合物，可预防、治疗 心血管疾病，也是用于糖尿病更有效的药物，具有降低空腹血糖的作用。上述专利中，乳酸铬和《_3脂肪酸铬存在原料成本高的缺陷，特别是w-3脂肪酸反应条件苛刻导致该原料不易得；而乳酸铬和葡萄糖酸铬在制备过程中引入的氢氧化钡以及在制备过程中产生的中间产物氢氧化铬不易和目标产物分离，导致产品有害杂质含量过闻，品质大大降低。氨基酸铬是氨基酸与水溶三价铬合成得到的氨基酸铬络合物，服用氨基酸铬，不仅摄入了有生物活性的三价铬，而且给人体带来必需的无毒营养成分.迄今已合成多种氨基酸铬，如蛋氨酸、亮氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸等都已被用于制备氨基酸铬。乳铁蛋白(Iactoferrin)是具有与金属离子络合能力的单链糖蛋白，一个乳铁蛋白分子可以同两个铬离子结合。乳铁蛋白本身具有广效抗菌功能，并能调节体内免疫系统，乳铁蛋白与三价铬离子形成的铬络合物同时具有乳铁蛋白和三价铬的功能。中国专利CN 1406940从含有叶绿素的天然原料中提取叶绿素(或工业品糊状叶绿素)，与氯化铬反应制备了叶绿素铬。叶绿素铬所含铬卟啉具有催化氮化碳氢化合物的能力，参与生理物质的生物合成，能代谢外源性化合物和内源性化合物；上述叶绿素铬具有生物活性，适于生产治疗糖尿病的降血糖、降血脂类药物。中国专利CN 1379043利用脱晶几丁糖在氮气保护下与硝酸铬制取的几丁铬，对四氧嘧啶引起高血糖小鼠进行实验，结果显示喂饲几丁糖铬有降低空腹血糖作用，比皮考啉酸铬更明显。国内张磊等(2002年)报道了海藻多糖铬络合物(SPC)降糖作用的实验研究。海藻多糖有用于糖尿病治疗的报道，海藻多糖铬络合物由海藻多糖与三价铬络合而成，具有一般纤维素所不具备的理化性质。SPC预防性给药各剂量组均能显著抑制四氧嘧啶所致大、小鼠血糖升高，提示其对预防血糖的升高有重要作用。陈秀敏(2003年)等报道制备了魔芋葡甘露寡糖铬(III)络合物，研究络合物的理化性质及生物活性，证明是羟基与铬的空轨道形成配合物。王狲等(2006年)报道了制备富铬酵母蛋白质，通过红外光谱法测定了富铬前、后的酵母蛋白质，对比发现富集转化后，生物材料蛋白质特征峰发生显著变化，证实了铬与蛋白质的结合。邓毅等(2007年)报道制备黄芪多糖的铬络合物，并用IR、UV手段初步表征了络合物的形成。黄芪多糖的分子量较大，约在10万道尔顿以上，有文献报道黄芪多糖能降低葡萄糖负荷，对抗肾上腺素引起的小鼠血糖升高。谷彩霞等(2008)，将藻酸双酯钠(PSS)与三价铬离子在不同pH条件下进行络合，制备PSS铬配合物(PSS-Cr)，所制备的PSS-Cr中的铬含量达6. 69%，重均相对分子质量为12188Da。将PSS与Cr3+进行配合有望发挥两者的协同作用。中国专利CN 101691410A (2009)公开了一种具有防治胰岛素抵抗作用的海洋寡糖铬配合物，该寡聚糖金属配合物的糖残基之间均由a-l，4-L-古罗糖醛酸组成，重均分子量< 12kD，三价铬质量百分含量为0.1 12%。该产品融合了海洋寡糖和三价铬的优点，具有防治胰岛素抵抗、调节糖和脂代谢紊乱作用。中国专利CN 101649004A (2009)提供了一种海洋聚甘露糖醛酸寡糖铬配合物，其配体糖的残基由D-甘露糖醛酸组成，并以^ -1, 4-糖苷键连接，与三价铬离子进行配位络合制备，铬的质量百分含量为0. 1-15%，重均分子量< 10kD，该聚甘露糖醛酸寡糖铬配合物用于II型糖尿病的防治。上述藻酸双酯钠铬配合物(PSS-Cr)、古罗糖醛酸铬配合物和聚甘露糖醛酸寡糖铬配合物的糖配合物均为海藻多糖的水解产物或分级组分，虽为低聚糖或寡糖，但其分子量比普通寡糖高，均在10000 Dalton左右，且为糖酸或糖醛酸，铬与其羧基络合生成配合物，因此铬含量相对较低。综上所述，具有生物活性的有机铬种类繁多，但是，因它们的溶解性和被肠吸收的比例差别很大，生物活性各不相同，有些溶解性差，生物利用度低，有些阴离子配合物对人体有不利影响，有些制备过程中反应条件苛刻，这就使得开发新的溶解性好、易吸收和生物活性强、生物利用率高，无副 作用或副作用低的有机铬络合物(螯合物)，成为铬化合物的一个重要的新增长点。
发明内容
为了满足上述技术发展的需要，本发明提供了一种利用真菌葡寡糖为配体化合物，以三价铬为配位中心离子制备的3-葡寡糖或a-葡寡糖铬络合物及其制备方法，所制备的葡寡糖铬络合物含铬量适宜，稳定性高，水溶性好，易于吸收，不含游离Cr6+离子，解离后的配体化合物无毒副作用，生物活性高，为同时具有GTF类似功能和免疫调节作用的活性物质。本发明所述的一种真菌葡寡糖铬络合物，寡糖铬络合物的配体化合物为真菌葡寡糖，真菌葡寡糖的重均分子量为300-3000Dalton，络合物中的铬含量为5-20%重量分数。采用的配合物为真菌寡糖，也就是小分子多羟基碳水化合物，其分子量低，溶解性好，具有多种生物活性。结构中的多个羟基可提供孤对电子，可与多种中心离子形成稳定的络合物。本发明将多糖的免疫调节活性和Cr3+的葡萄糖耐受因子活性结合起来，提供了一种具有多种生物活性的新型有机铬络合物。寡糖作为配体化合物的铬络合物与吡啶羧酸铬、脂肪族有机酸铬络合物相比具有溶解性好，配体化合物的无副作用或副作用小的优点；与氨基酸铬比较具有合成条件温和，产物形成过程易控制的优点；与高铬酵母相比，具有生产周期短，不含有毒副作用的Cr6+等优点。与海藻多糖铬络合物、黄芪多糖的铬络合物和麦冬多糖铬络合物相比，葡寡糖铬络合物的配体化合物葡寡糖分子量低，除具有母体多糖所具有的各种活性外，更有利于吸收和利用，而且其母体原料可快速大规模的生产，与植物多糖相比具有原料易得的优势。与魔芋葡甘露寡糖铬(III)络合物相比，葡寡糖铬络合物的配体化合物葡寡糖为3 -低聚葡聚糖，具有更强的免疫调节和与中心原子铬的协同作用。与几丁糖铬相比，葡寡糖铬络合物的制备工艺要温和简单得多，条件更易控制。与魔芋葡甘露寡糖铬(III)络合物相比，真菌葡寡糖更容易获得高浓度的寡糖溶液，这对于单位体积生产量的产率提高具有重要意义。上述的真菌寡糖为真菌多糖经糖苷酶在一定条件下水解制备的低聚糖，为2-20个单糖组成的单糖低聚体，分子量300-3000 Dalton。本发明中采用制备寡糖的真菌多糖为小核菌葡聚糖(Scleroglucan)或核盘菌多糖(Sclerotan)或范霉多糖(Pullulan)或水溶性酵母葡聚糖(P -1, 3-D-Glucan),前三者为目前可工业化生产的真菌胞外多糖，是通过液体发酵培养菌丝体和发酵液中制备而来；水溶性酵母葡聚糖为酵母3 -1, 3-D-葡聚糖的新工艺产品。四种多糖均为市售产品。小核菌葡聚糖，又称硬葡聚糖，呈线性结构，由D-吡喃葡萄糖通过￠-1, 3-D-糖苷键相连形成主链，再与单个D-吡喃葡萄糖单位以P-l，6-D-糖苷键相连形成支链。硬葡聚糖在冷热水中均可溶解，溶液具有很高的假塑性，不受温度、PH和电解质变化的影响，稳定性也强。在发酵时多糖的分子量受条件的影响较小。此聚合物与水的结合性、稳定性、黏稠性和悬浮性特性良好。小核菌葡聚糖本身具有重要的免疫调节、抑制肿瘤、抗病毒、抗感染等功效，具有明显的抗补体活性和促进巨噬细胞、淋巴细胞增殖的作用，对提高机体免疫力具有重要的作用。核盘菌多糖(SSG,Sclerotan)为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)产生的胞外多糖，也是以P-l，6-D-葡聚糖分支的￠-1, 3-D-葡聚糖，结构和性质与小核菌葡聚糖非常相似，但分子量要高很多，一般在80万Dalton以上，在水中溶解缓慢，粘度较高，并具有良好的流变学性质，其特性粘度几乎不随离子强度的变化而改变，在PH1. 8-12. 3之间，特性粘度值变化不显著，但当PH值为13. 32时，由于分子构象的变化导致特性粘度值急骤下降。温度< 90°C和热处理对SSG溶液的表观粘度影响不大。SSG具有潜在的免疫调节活力和明显的抑瘤作用。 范霉多糖,又称短梗霉多糖或普鲁兰(Pullulan),是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)分泌的一种粘性多糖。它是一种以淀粉或糖类为原料，经微生物发酵产生的细胞外纯天然高分子多糖。其化学组成主要是由a -1. 6-葡萄糖苷键连接的聚麦芽三糖。分子结构中含1/3的a-1. 6-葡萄糖苷键。2/3的a-1. 4-葡萄糖苷键。茁霉多糖是无色、无味、无臭的高分子物质，白色粉末状，是非离子性、非还原性多糖。它无毒、安全、易溶于水、粘度低，具良好耐热性和耐酸碱性。人体消化酶不能水解a -1. 6葡萄糖苷键，因此短梗霉多糖在人体内仅生成1/3的葡萄糖可被吸收利用。还有2/3生成异麦芽糖或潘糖不能被人体消化吸收。但异麦芽糖和潘糖具有刺激人体肠道内双歧杆菌生长的生理功能，所以短梗霉多糖不但可作为糖尿病和肥胖症患者的低热值食品，也可单独作为保健食品。酵母水溶性葡聚糖，为酵母碱提取的水溶性中性P葡聚糖，其原料为啤酒工业的废弃酵母，利用甘露聚糖和葡聚糖联产新工艺(CN101353383)，可获得天然水溶性￠-1, 3-D-葡聚糖。酵母水溶性葡聚糖为酵母菌胞内多糖，其结构特性与小核菌葡聚糖类似。小核菌葡聚糖、核盘菌多糖、茁霉多糖和水溶性酵母P -1, 3-D-葡聚糖均可大规模生产，原料易得、工艺成熟、成本低廉，易于工业化生产，其产品已分别用于石油工业和食品工业。将小核菌葡聚糖、核盘菌多糖、茁霉多糖和水溶性酵母3-1，3-D-葡聚糖降解后进行衍生化生成的寡糖铬配合物是一种新型补铬制剂。制备本发明所述的真菌葡寡糖铬络合物的方法，其步骤如下(I)真菌葡寡糖的制备用糖苷水解酶将小核菌葡聚糖或核盘菌多糖或茁霉多糖或水溶性酵母3-1，3-D-葡聚糖水解为葡寡糖，再用蛋白酶除杂，分别用不同截留分子量的超滤膜和纳滤膜去除不需要的大分子和小分子，即得葡寡糖溶液；(2)寡糖铬的合成将步骤(I)制备的寡糖溶用碱液调节pH，使溶液的pH保持在8. 5-13. 2，加热至温度为40-80°C时滴加铬化合物，期间添加碱液以保持上述的pH范围，当溶液中刚出现绿色絮状沉淀时，停止加入碱和铬化合物，反应液继续在反应温度下保温Ih ；(3)寡糖铬的分离用高分子量的超滤膜超滤，收集滤出液，再用低分子量的纳滤膜超滤，收集截留液；所述高分子量的超滤膜是指截留分子量为6000-10000Dalton的超滤膜，所述低截留分子量的纳滤膜是指截留分子量为100-300Dalton的纳滤膜；(4)寡糖铬的纯化将步骤(3)所获得的截留液，经柱层析进一步纯化后，冷冻干燥或喷雾干燥即可。其中步骤(I)真菌葡寡糖的制备方法具体如下双酶法水解，将小核菌葡聚糖或核盘菌多糖或茁霉多糖或水溶性酵母^ -1, 3-D-葡聚糖溶于水，调节pH至4-5的范围内，加热至40-55°C，加入葡聚糖水解酶，保温2-4h ;调节pH至7-8的范围内，加入蛋白酶，在40-60°C下保温2_4h ;升温至90_100°C，灭酶活；离心，去除不溶物，用高截留分子量的超滤膜超滤，收集滤出液，再用低截留分子量的超滤膜超滤，收集截留液；即为所需分子量的葡寡糖；所述的葡聚糖水解酶为糖苷水解酶，选自a -葡聚糖酶或0 -葡聚糖酶或a -淀粉酶或3-淀粉酶或3-甘露聚糖酶或果胶酶或纤维素酶中的一种或数种的混合物；酶用量相对于葡寡糖的0. 05-0. 2%w/w ;蛋白酶选自木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶或碱性蛋白酶或蜗牛酶或胰蛋白酶或中性蛋白酶中的一种；酶用量相对于葡寡糖的0. 05-0. 2%w/w ；步骤(1)采用两步截留切割分离不同分子量的物质，分别去除高于和低于所需分子量的非目的分子；所述高截留分子量的超滤膜是指截留分子量为6000-10000Dalton的超滤膜，用以去除6000Dalton以上的大分子；所述低截留分子量的纳滤膜是指截留分子量为100-300Dalton的纳滤膜，用以去除IOODalton以下的小分子，未反应的盐及其他溶剂也同时被脱除；上述葡聚糖水解过程中，一次投料制备的葡寡糖溶液浓度一般在5%(w/v)左右，高的可达7% (w/v)，采用分批投料法可制备高浓度葡寡糖溶液。先加入部分葡聚糖使葡聚糖悬浮于水中，搅拌使充分溶胀，再加入部分糖苷水解酶，剧烈搅拌，直至溶液变稀，再重复投入葡聚糖和糖苷水解酶，糖苷水解酶可一次性投入。反复2-4次，可制备含量10%-25% (w/v)的葡寡糖溶液。步骤(2)中，反应所需温度为40_80°C ;反应进行时所需的pH范围在8. 5-13. 2之间，更优选的在8. 5-12. 5之间，调节反应液pH值的碱液为NaOH溶液或KOH溶液或Na2CO3溶液，浓度为0. 5-5mo 1/L，优选浓度为2mo 1/L，调节方式为间歇调节；之所以采用如此高的PH值，主要考虑到13. 3是寡糖螺旋结构解体的临界pH，本发明所采用的高碱性的pH值(13. 2以下)可促使糖分子中的羟基能够脱质子形成孤对电子，而同时又不使糖分子的三位螺旋结构遭到破坏，同时所形成的寡糖铬络合物又不发生水解，因而可以获得最大的收率，这也是本发明与现有铬络合物制备过程中的一大改进；所述配位中心离子铬供体为三价铬化合物，具体为氯化铬、硫酸铬、硝酸铬、磷酸铬、醋酸铬中的一种，滴加的铬化合物浓度为0. 5-2mol/L，优选浓度为2mol/L ;整个反应过程时间控制在1. 5-4. 5h为宜；而步骤(4)中所采用的层析柱,选自Sephadex_G25或Sephadex_G50的葡聚糖凝胶柱，DEAE Sepharose-CL_4B 或 DEAE Sepharose-CL_6B 的琼脂糖凝胶柱，或填料为 60-800目硅胶粉的硅胶柱，经柱层析分离，可将3000Dalton以上的非目标大分子进一步脱除，达到分离纯化的目的。按照上述寡糖铬络 合物的制备技术，可分别制备小核菌3 -葡寡糖铬络合物、核盘菌3 -葡寡糖铬络合物、普鲁兰a -葡寡糖铬络合物和酵母3 -葡寡糖铬络合物，这几种铬络合物均具有相似的理化特性和生物活性，且合成条件温和，产物形成过程易控制的优点，反应时间短，所获产物水溶性好，稳定性高，酶法制备寡糖更容易获得高浓度的寡糖溶液，这对于单位体积生产量的产率提高具有重要意义。葡寡糖铬络合物在体内吸收水解后，既提供微量元素铬促进糖代谢和脂代谢，同时又提供具有生物活性的葡寡糖增强免疫调节等协同活性。经动物经口灌胃实验证实，本发明工艺技术所制备的葡寡糖铬络合物，在实验进行过程中，对正常小鼠和糖尿病小鼠的体重变化无显著影响；对正常小鼠和糖尿病小鼠的空腹血糖变化无显著影响；对糖尿病小鼠的血糖下降百分率也无显著影响。但葡寡糖铬络合物对糖尿病小鼠的血糖曲线下面积有显著影响，与溶剂对照组的血糖曲线下面积相比，试验组动物的血糖曲线下面积明显减少且有显著性差异。对血糖曲线下面积产生影响的剂量范围是20-6(^8/1^. bw。说明葡寡糖铬络合物能明显增强糖尿病小鼠的葡萄糖负荷耐糖量，具有一定的辅助降血糖功能。综上所述，本发明所获得的葡寡糖铬络合物是由P -葡寡糖或a -葡寡糖在一定条件下与三价铬离子形成的络合物，体外环境中稳定，在体内环境中，解离出Cr3+被人体吸收，起到葡萄糖耐糖因子的作用，促进胰岛素的活性，调节糖代谢，增加糖的利用和促进糖的运转，同时调节脂代谢。另一方面，解离出的￠-葡寡糖或a-葡寡糖进而发挥其提高机体免疫力的功效。因此葡聚糖铁络合物同时具有调节糖代谢、调节脂代谢和提高免疫力的功效。
具体实施例方式下面以具体实施例进一步对本发明的内容进行说明。本发明所涉及的内容包含但不限于如下具体实施例。
实施例1小核菌￠-葡寡糖的制备将小核菌葡聚糖15g，悬浮于IOOmL水中，搅拌，使充分溶胀，调pH值4_5，加热到50°C加入30mg ￠-葡聚糖酶，搅拌下水解l_2h ;再加入葡聚糖10g，持续搅拌l_2h，溶液变稀并逐渐透明；调节PH至7-8，加入中性蛋白酶20mg，保温2_4h ;升温至90°C，灭酶活；6000r/min离心20min，用截留分子量为IOkDa的超滤膜超滤，收集滤出液，再用截留分子量为200Dalton的纳滤膜超滤，收集截留液；即为重均分子量2528Dalton的葡寡糖。该葡寡糖溶液中含3 -葡寡糖22. 51% (w/v)0实施例2小核菌P -葡寡糖铬的合成与纯化小核菌0 -葡寡糖溶液IOOmL,含重均分子量2240Dalton的葡寡糖15. 37% (w/V)，用10mol/L的NaOH调节pH值至12，加热至75°C，滴加2mol/L的氯化铬，期间用2mo I/L的NaOH调节pH使pH值稳定在12左右，当溶液中刚出现绿色絮状沉淀时，停止滴加氯化铬和NaOH，反应液继续在75°C下保温lh。用截留分子量为200Dalton的纳滤膜超滤，收集截留液；再经200-300目的硅胶柱层析进一步纯化后，冷冻干燥，即得小核菌￠-葡寡糖铬
8.6g。￠-葡寡糖铬收率56%，铬含量7. 43%w/w。其中所得寡糖铬络合物中的寡糖含量采用硫酸-苯酚分光光度法测定；寡糖铬络合物中的铬含量采用二苯氨基脲分光光度法测定。二苯氨基脲分光光度法测定铬含量的原理样品经干法消化进行有机破坏后，其残留的铬配成溶液在碱性条件下用高锰酸钾氧化成六价铬离子，而六价铬在碱性条件下可与二苯氨基脲发生反应生成紫红色的络合物，且其络合物溶液的颜色深浅与六价铬离子的浓度成正比，从而可以进行比色测定其中铬的含量，此为总铬的含量。具体测定步骤为标准工作曲线的绘制将0.1g / mL的铬标准溶液配成10 U g/mL的标准溶液，取50mL容量瓶6支，分别加入0. O、1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. OmL的铬标准溶液(10 u g/mL);在各支容量瓶中分别加入20%碳酸钠5mL ;在各支容量瓶中各加入适量的水，使其每个容量瓶总体积相等，大约25 30mL ；在已配好的标准溶液中加入2%高锰酸钾溶液5 10滴。溶液成紫红色，在电炉上加热至沸腾并保持5 IOmin ;沿壁加入95%乙醇2 5mL，继续加热使溶液变为棕黄色；冷却至室温，用5mol/L硫酸调其pH值为I 3 ;将溶液过滤至50mL容量瓶用蒸馏水定容；加入2. 5mL 二苯胺基脲溶液，显色IOmin左右，以空白液为参比液，在于540nm处测其吸光度。计算出线性回归方程和相关系数。样品的预处理用干法消化精密称取80°C干燥至恒重的样品，分别置于瓷坩埚中，各加入溶液5mL使之充分润湿，先低温炭化，待浓烟散尽后，移580°C高温炉中灰化成白色或灰色灰烬，冷却，分别用25mL水将其白色灰烬分次洗人150mL锥形瓶，以待测定。样品中总铬含量的测定对已消化好的样品溶液进行测定，用与标准曲线制作同样的方法步骤，由标准工作曲线的回归方程即可求出样品中总铬的含量样品铬的含量=(样品浓度X测定时的体积)/样品的质量实施例3出芽短梗霉a-葡寡糖的制备
普鲁兰10g，悬浮于IOOmL水中，搅拌，使充分溶胀，调pH值4-5，加热55°C，加入IOmg a -1, 6-葡聚糖酶,搅拌下水解2h ;再加入葡聚糖5g, a -淀粉酶IOmg持续搅拌l_2h,溶液变稀并逐渐透明；调节PH至7-8，加入碱性蛋白酶15mg，保温2-4h ;升温至100°C，灭酶活；6000r/min离心20min,用截留分子量为6000Dalton的超滤膜超滤,收集滤出液,再用截留分子量为300Dalton的纳滤膜超滤，收集截留液；即为重均分子量1650Dalton的葡寡糖。该葡寡糖溶液中含a-葡寡糖12. 6% (w/v)0实施例4核盘菌P -葡寡糖的制备核盘菌P -葡聚糖20g,悬浮于300mL水中，搅拌,使充分溶胀,调pH值4-5,加热55°C，加入30mg ￠-葡聚糖酶，搅拌下水解2h ;再加入葡聚糖5g，持续搅拌l_2h，溶液变稀并逐渐透明；调节pH至7-8,加入中性蛋白酶15mg,保温2-4h ;升温至100°C,灭酶活；6000r/min离心20min,用截留分子量为6000Dalton的超滤膜超滤,收集滤出液,再用截留分子量为300Dalton的纳滤膜超滤，收集截留液；即为重均分子量2760Dalton的葡寡糖。该葡寡糖溶液中含a -葡寡糖17. 3% (w/v)0实施例5酵母￠-葡寡糖铬络合物的制备(I) P -葡寡糖的制备将酵母水溶性3-1，3-D-葡聚糖15g，悬浮于IOOmL水中，搅拌，使充分溶胀，调pH值4-5,加热到45°C加入45mg ^ -葡聚糖酶,搅拌下水解0. 5_2h ；再加入葡聚糖15g，持续搅拌l_2h，溶液变稀并逐渐透明；调节pH至7-8，加入菠萝蛋白酶25mg,保温2-4h ;升温至95°C,灭酶活；6000r/min离心20min,用截留分子量为IOkDalton的超滤膜超滤，收集滤出液，再用截留分子量为300Dalton的纳滤膜超滤，收集截留液；即为重均分子量1510Dalton的葡寡糖。该葡寡糖溶液中含P -葡寡糖25. 63% (w/v)0
(2)0-葡寡糖铬的合成小核菌￠-葡寡糖溶液IOOmL,含葡寡糖25.63%(w/v)，用5mol/L的KOH调节pH值至12，加热至70V，滴加2mol/L的硫酸铬，期间用2mol/L的KOH调节pH，使pH值稳定在12左右，当溶液中刚出现绿色絮状沉淀时，停止滴加硫酸铬和K0H，反应液继续在70°C下保温Ih。(3) ^ -葡寡糖铬的纯化用截留分子量为300Dalton的纳滤膜超滤，收集截留液；再经S印hadeX-G50柱层析进一步纯化后，冷冻干燥，即得小核菌3 -葡寡糖铬12. 3g。
3_甸募糖络收率48%,络含量11. 03%w/w。实施例6小核菌￠-葡寡糖铬络合物的制备(I) ￠-葡寡糖的制备将小核菌葡聚糖5g，悬浮于IOOmL水中，搅拌，使充分溶胀，调pH值4-5,加热到40°C加入5mg ￠-葡聚糖酶和5mg P -淀粉酶,搅拌下水解0. 5_lh ;再加入葡聚糖15g，￠-葡聚糖酶20mg，持续搅拌l_2h，溶液变稀并逐渐透明；调节pH至7-8，加入木瓜蛋白酶25mg,保温2-4h ;升温至90°C,灭酶活；6000r/min离心20min,用截留分子量为8000Dalton的超滤膜超滤，收集滤出液，再用截留分子量为IOODalton的纳滤膜超滤，收集截留液；即为重均分子量1350Dalton的葡寡糖。该葡寡糖溶液中含P _葡寡糖17. 42%(w/v)。(2) ￠-葡寡糖铬的合成小核菌￠-葡寡糖溶液IOOmL,含葡寡糖17.42% (w/v),用5mol/L的NaOH调节pH值至12，加热至60°C，滴加2mol/L的醋酸铬，期间用2mol/L的NaOH调节pH，使pH值稳定在10左右，当溶液中刚出现绿色絮状沉淀时，停止滴加醋酸铬和NaOH,反应液继续在60°C下保温Ih。(3) ￠-葡寡糖铬的纯化用截留分子量为IOODalton的纳滤膜超滤，收集截留液；再经DEAE Sepharose-CL-4B柱层析进一步纯化后，冷冻干燥，即得小核菌P _葡寡糖铬
6.67g。￠-葡寡糖铬收率38. 3%，铬含量9. 28%w/w。实施例7小核菌￠-葡寡糖铬络合物的制备(I) P -葡寡糖的制备将小核菌葡聚糖10g，悬浮于IOOmL水中，搅拌，使充分溶胀，调pH值4-5,加热到50°C加入5mg P -葡聚糖酶和5mg果胶酶，搅拌下水解0. 5_lh ;再加入葡聚糖5g，￠-葡聚糖酶20mg，持续搅拌l-2h，溶液变稀并逐渐透明；调节pH至7-8，加入碱性蛋白酶25mg,保温2-4h ;升温至90°C,灭酶活；6000r/min离心20min,用截留分子量为IOkDalton的超滤膜超滤，收集滤出液，再用截留分子量为200Dalton的纳滤膜超滤，收集截留液；即为重均分子量2380Dalton葡寡糖。该葡寡糖溶液中含P -葡寡糖11. 27%(w/V)。
(2) ￠-葡寡糖铬的合成小核菌￠-葡寡糖溶液IOOmL,含葡寡糖11.27% (w/v),用5mol/L的NaOH调节pH值至12，加热至75°C，滴加2mol/L的醋酸铬，期间用2mol/L的NaOH调节pH使pH值稳定在9左右，当溶液中刚出现绿色絮状沉淀时，停止滴加醋酸铬和NaOH,反应液继续在60°C下保温Ih。(3) ￠-葡寡糖铬的纯化用截留分子量为200Dalton的纳滤膜超滤，收集截留液；再经400目的硅胶柱层析进一步纯化后，冷冻干燥，即得小核菌￠-葡寡糖铬5. 32g。￠-葡寡糖铬收率47. 2%，铬含量7. mm 11实验例^ -葡寡糖铬络合物的应用例对昆明种小白鼠血糖的影响。试验动物SPF级健康雌性昆明种小白鼠，体重25_29g ;试验样品实施例7制备的小核菌P -葡寡糖铬络合物，用蒸馏水溶解，配制成150mg/mL的原液，使用时分别稀释1000倍、3000倍和6000倍，即为高、中、低剂量的浓度，分别为150 ii g/mL、50 ii g/mL和25 ii g/mL ;各组小鼠均按0. 2mL/10g. bw经口灌胃，则低、中、高各剂量组的剂量分别为10 V- g/kg. bw、20 V- g/kg. bw、60 u g/kg. bw,以蒸懼水作为溶剂对照。降低空腹血糖试验实验鼠尾静脉注射45mg//kg. bw剂量的四氧喃唳建立糖尿病模型，7d后取尾血测实验前血糖值；按上述剂量连续给予受试物30d，禁食5d (自由饮水)后，取尾血测实验后血糖值，比较各组动物血糖值和血糖下降百分率。血糖下降百分率=(实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值X 100%糖尿病小鼠的葡萄糖负荷耐糖量试验各组模型动物禁食5d (自由饮水)，实验组给予不同剂量的样品，对照组给予蒸馏水，20min后都给予2g//kg. bw的葡萄糖溶液，测定给葡萄糖溶液后0h、0. 5h、2h的血糖值，比较各组动物铬时间点血糖曲线下面积的变化。血糖曲线下面积=0. 25 X (Oh血糖值+4X 0. 5h血糖值+3 X 2h血糖值)经连续给予受试物30d，禁食5d (自由饮水)后观察的结果，^ -葡寡糖铬络合物各剂量组正常小鼠的初期体重、中期体重和结束体重与对照组相比，无显著性差异(P>0. 05)；各剂量组糖尿病小鼠的初期体重、中期体重和结束体重与对照组相比，无显著性差异(p>0. 05)。各剂量组正常小鼠的空腹血糖与对照组相比，无显著性差异(p>0. 05);各剂量组糖尿病小鼠试验后与试验前的空腹血糖值与对照组相比，无显著性差异(P>0. 05);各剂量组糖尿病小鼠试验后与试验前的血糖下降百分率(-11. 3±32. 6,-8. 7±36. 26,-9. 6±24.18 )与对照组相比(11. 6 ± 33. 28 )，也无显著性差异(p>0. 05 )。^ -葡寡糖铬络合物中剂量组(20 V- g/kg. bw)和高剂量组(60 V- g/kg. bw)作用于糖尿病小鼠后的血糖曲线下面积(44. 3 ±6. 48、42.1 ±6. 73)，与溶剂对照组的血糖曲线下面积(49. 5±4. 76)相比，明显减少且有显著性差异(p〈0. 05)。
说明￠-葡寡糖铬络合物能明显增强糖尿病小鼠的葡萄糖负荷耐糖量，具有一定的辅助降血糖功能。
权利要求
1.一种真菌葡寡糖铬络合物，其特征在于寡糖铬络合物的配体化合物为真菌葡寡糖，真菌葡寡糖的重均分子量为300-3000Dalton，络合物中的铬含量为5_20wt%。
2.根据权利要求1所述的真菌寡糖铬络合物，其特征在于配体寡糖为3-葡寡糖或a -葡寡糖，由小核菌葡聚糖或核盘菌多糖或茁霉多糖或水溶性酵母3 -1, 3-D-葡聚糖制得。
3.制备如权利要求1所述的真菌葡寡糖铬络合物的方法，其步骤如下 (1)真菌葡寡糖的制备 用糖苷水解酶将小核菌葡聚糖或核盘菌多糖或茁霉多糖或水溶性酵母3 -1, 3-D-葡聚糖水解为葡寡糖，再用蛋白酶除杂，分别用不同截留分子量的超滤膜和纳滤膜去除不需要的大分子和小分子，即得葡寡糖溶液，其浓度为7%-25%w/v ； (2)寡糖铬的合成 将步骤(I)制备的寡糖溶液用碱液调节pH，使溶液的pH保持在8. 5-13. 2，加热至温度为40-80°C时滴加铬化合物，期间添加碱液以保持上述的pH范围，当溶液中刚开始出现绿色絮状沉淀时，停止加入碱液和铬化合物，反应液继续在反应温度下保温Ih ； (3)寡糖铬的分离 用高分子量的超滤膜超滤，收集滤出液，再用低分子量的纳滤膜超滤，收集截留液；所述高分子量的超滤膜是指截留分子量为6000-10000Dalton的超滤膜，所述低截留分子量的纳滤膜是指截留分子量为100-300Dalton的纳滤膜； (4)寡糖铬的纯化 将步骤(3)所获得的截留液，经柱层析进一步纯化后，冷冻干燥或喷雾干燥即可。
4.根据权利要求3所述的真菌寡糖铬络合物的制备方法，其特征在于步骤(I)真菌葡寡糖的制备方法具体如下 双酶法水解，将小核菌葡聚糖或核盘菌多糖或茁霉多糖或水溶性酵母3 -1, 3-D-葡聚糖溶于水，调节pH至4-5的范围内，加热至40-55°C，加入葡聚糖水解酶，保温2_4h ;调节pH至7-8的范围内，加入蛋白酶，在40-60°C下保温2-4h ;升温至90-100°C，灭酶活；离心，去除不溶物，用高截留分子量的超滤膜超滤，收集滤出液，再用低截留分子量的超滤膜超滤，收集截留液；即为所需分子量的葡寡糖； 所述的葡聚糖水解酶为糖苷水解酶，选自a-葡聚糖酶或3-葡聚糖酶或a-淀粉酶或@-淀粉酶或3-甘露聚糖酶或果胶酶或纤维素酶中的一种或数种的混合物；酶用量相对于葡寡糖的0. 05-0. 2%w/w ;蛋白酶选自木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶或碱性蛋白酶或蜗牛酶或胰蛋白酶或中性蛋白酶中的一种；酶用量相对于葡寡糖的0. 05-0. 2%w/w。
5.根据权利要求4所述的真菌寡糖铬络合物的制备方法，其特征在于所述高分子量的超滤膜是指截留分子量为6000-10000Dalton的超滤膜，所述低截留分子量的纳滤膜是指截留分子量为100-300Dalton的纳滤膜。
6.根据权利要求4所述的真菌寡糖铬络合物的制备方法，其特征在于制备高浓度葡寡糖溶液的投料方式为分批投料，投料次数为2-4次。
7.根据权利要求3所述的真菌寡糖铬络合物的制备方法，其特征在于步骤(2)寡糖铬的合成中所采用的调节反应液PH值的碱液为NaOH溶液或KOH溶液或Na2CO3溶液，浓度为0. 5-5mol/L ;所述铬化合物为三价铬化合物,选自氯化铬或硫酸铬或硝酸铬或磷酸铬或醋酸铬。
8.根据权利要求3所述的真菌寡糖铬络合物的制备方法，其特征在于步骤(2)寡糖铬的合成过程中的pH值范围为pH=8. 5-12. 5。
9.根据权利要求3所述的真菌寡糖铬络合物的制备方法，其特征在于步骤(4)中所采用的层析柱，选自Sephadex_G25或Sephadex_G50的葡聚糖凝胶柱，DEAE Sepharose-CL_4B或DEAE S印haroSe-CL-6B的琼脂糖凝胶柱，或填料为60-800目硅胶粉的硅胶柱。
全文摘要
本发明涉及生物工程技术领域和食品医药领域，具体提供了一种利用真菌葡寡糖为配体化合物，以三价铬为配位中心离子制备的葡寡糖铬络合物及其制备方法，所制备的葡寡糖铬络合物含铬量适宜，稳定性高，水溶性好，易于吸收，不含游离Cr6+离子，解离后的配体化合物无毒副作用，生物活性高，为同时具有GTF类似功能和免疫调节作用的活性物质。
文档编号C12P19/14GK103059154SQ201210498778
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者王宝琴, 徐泽平 申请人:滨州学院, 王宝琴