用RNAi有效防治农业害螨的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及沉默一个能量代谢基因防治叶螨的方法。根据本发明的方法包括以下步骤：选取叶螨致死基因AK为RNAi靶基因；将其连接至质粒载体L4440中，转化至大肠杆菌HT115，获得具有表达AK基因dsRNA的菌株。本发明是对以杀虫剂为主的叶螨防治方法的重要补充。本发明利用RNAi技术干扰叶螨体内的能量代谢相关基因的表达，为防治叶螨提供了技术支持。
【专利说明】用RNAi有效防治农业害螨的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物【技术领域】；更具体地，本发明涉及基于RNAi技术防治农业害 螨的靶标基因及其dsRNA，描述了将靶标基因合成为双链RNA制剂并直接应用于农业害螨 防治的方法。 技术背景
[0002] 在我国，目前对农业害螨还没有有效防治方法，喷施杀虫剂仍然是主要防治手段。 高毒高残留农药的滥施，不仅导致农作物产品质量下降，害螨抗药性的增加，而且已危及人 们的生命安全和健康。因此，生产上迫切需要发展安全、有效、新型的策略来控制害螨种群 的危害。
[0003] RNAi现象自从1991年发现以来迅速发展，研究表明，通过特异基因的RNAi，可以 达到定向干涉物种的靶基因，出现某些生理现象，达到研究基因功能的目的，同时，这种现 象有着极高的特异性，即同源基因的特定片段对不同物种所发挥的干涉效果并不相同，因 此是一种理想的害虫种类特异的防治体系。
[0004] 迄今为止通过dsRNA诱导的RNAi已被广泛用来研究昆虫基因的功能，但是应用 于螨类的研究极少（Khila，2007 ;Campbell，2010)，这主要是因为螨类个体微小（身体多 在1毫米以下），使用RNAi分子技术操作困难。KhiIa等（2007)使用dsRNA注射腹部，成 功沉默了二班叶螨（Tetranychus urticae)的Distal-less基因，导致叶螨须肢截断畸形 和附足融合。将绿色荧光蛋白GFP标记的dsRNA分子注射入雌成螨的腹部，而在其产的卵 中亦可检测到，表明螨类中也可能存在RNAi系统性传播。Campbell等（2011)使用0.9% NaCl溶液浸泡法，成功沉默了西方蜜蜂（Apis mellifera)的寄生性螨-狄氏瓦螨（Varroa destructor)的glutathioneS-transferase基因，其特异性沉默效率在转录水平上达到 87%。本专利发明就是利用实验室改进的dsRNA干扰方法，从农业害螨中筛选出经干扰后 能够导致叶螨死亡的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害螨的新策略提供序列和数 据基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针农业害螨的危害，提供基于RNAi技术的抗虫制剂及抗虫方法
[0007] 本发明的第一方面是提供该致死基因片段AK的dsRNA及其合成方法.
[0009] 本发明的第一方面可通过如下技术方案实现：
[0010] 农业害螨致死基因片段AK，序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 所述的叶螨致死基因片段AK的克隆方法，包括如下步骤：
[0012] (1)取叶螨，提取总RNA，以提取的叶螨总RNA合成cDNA第一条链；
[0013] (2)以步骤⑴合成的叶螨cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO. 2的上游 引物P1、序列为SEQ ID NO. 3的下游引物P2进行RT-PCR扩增；
[0014] (3) PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；
[0015] (4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至PMD18-T载体中，转化到大 肠杆菌Τορ-10,涂于含有Amp的LB培养基，37°C培养，过夜；
[0016] (5)菌液PCR鉴定，筛选阳性重组子图1 ;
[0017] (6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；
[0018] (7)全自动序列仪进行测序，得到SEQ ID NO. 1所示的AK基因片段。
[0019] 其中，所述的 RT-PCR 扩增体系为：10XEx PCR Buffer2. 5 μ L，2. 5mM dNTP Mixture2. 0 μ L，10 μ M 上游引物 PlL 0 μ L，10 μ M 下游引物 P2L 0 μ L，cDNA 模板 3 μ L， 5U/ μ L Ex TaqO. 25 μ L，ddH20,15. 25 μ L，共 25 μ L ;PCR 反应程序为：94 °C 变性 5min， 94°C lmin，56°C lmin，72°C lmin，32 个循环，72°C延伸。
[0020] 叶螨致死基因片段AK的dsRNA。
[0021] 基于分析克隆获得的靶标基因功能区域，设计特异引物分别扩增获得正向双链 DNA片段及反向双链DNA片段；使用体外高效转录试剂盒（HiScribe RNAi Transcription Kit)对获得的两条双链DNA靶标片段进行体外转录、退火合成dsRNA，构建出特异dsRNA.
[0022] 本发明的另一方面是提供重组质粒载体的构建及其dsRNA的表达
[0023] 所述的重组质粒载体的构建由以下方法实现：
[0024] (1)提取本发明第一方面中克隆的重组质粒PMD18-T-AK，用HindIII和Sac II进 行双酶切，获得两个黏性末端。
[0025] (2)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段。
[0026] (3)同样用HindIII和Sac II对L4440质粒进行双酶切，获得与（1)相同的黏型 末端。
[0027] (4)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段，作为载体。
[0028] (5)将（2)所得的目的片段与（4)所得的L4440质粒载体片段用T4DNA连接酶连 接，转化到大肠杆菌HT115中，涂于含有（Amp+Tet)的双抗LB平板，37°C培养，过夜；
[0029] (6)挑取单菌落，接种于2ml LB培养基（Amp+Tet)，37°C过夜培养，抽提质粒并进 行酶切鉴定。
[0030] 选择鉴定正确菌液0· 75ml并加入0· 25ml 80%甘油，-80°C保存
[0031] 本发明的另一方面是诱导大肠杆菌HT115进行dsRNA的表达。
[0032] 将上述保存的含有L4440-AK质粒的HTl 15菌液以1 : 100的体积接种于 (Amp+Tet)双抗的 2XYT 培养基中，37°C、250rpm 培养至 OD595 ?0· 4.
[0033] 加入无菌的IPTG至终浓度为0. 4mM于上述菌液，在37°C、250rpm诱导4h。
[0034] 鉴定诱导表达的dsRNA。
[0035] 本发明的另一方面是提供几种叶螨的dsRNA干扰方法，
[0036] 本发明另一方面叶螨dsRNA干扰第一种方法是玻片点滴法，具体步骤包括：
[0037] (1)将双面胶带剪成2cm长，贴在载玻片一端
[0038] (2)选择健康的雌成螨，用小号毛笔轻轻挑起，将其背部粘在胶带上，注意不要粘 住足、须肢及口器。
[0039] (3)每片粘30头，排成三排，然后把玻片放在干净无毒且湿润的托盘中，置于 28±1°C下培养箱
[0040] (4)0. 5h后在双目解剖镜下挑去不活泼和死亡个体并补足30头备用
[0041] (5)用规格2. 5 μ L移液枪在体视显微镜下往每头虫体背面滴加适量dsRNA。
[0042] 死亡标准：以小号毛笔轻轻触动螨体，附肢不动者为死亡。
[0043] 本发明另一方面叶螨dsRNA干扰第二种方法是dsRNA双通管法，具体步骤包括：
[0044] (1)在玻璃双通管一端先加一块Parafilm封口膜，然后将人工饲料加在其上，再往 其上盖住另一块新的Parafilm封口膜。
[0045] (2)然后往双通管中放入所要试验的叶螨。
[0046] (3)最后再往玻璃双通管另一端再按第（1)步所述的方法进行操作。
[0047] (4)添加完毕，用针尖向两端的双层Parafilm封口膜上各刺20(视具体情况）个微 孔，以便空气和水分流动；
[0048] (5)将叶螨放在人工气候箱饲养，往玻璃管中央盖一块黑布，以使叶螨能去两端吸 食人工饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料。
[0049] 其中，所述的dsRNA为所述的叶螨致死基因片段AK的dsRNA。
[0050] 有益效果：
[0051] 利用RNAi技术沉默AK基因，对叶螨具有明显的致死效果，说明该基因可作为利用 RNA干扰技术控制害虫的有效靶点。
[0052] 本发明合成的AK基因 dsRNA能有效沉默AK基因，更好地抵抗RNA酶的降解，同时 合成成本较低，便于大量实验使用。
[0053] 本发明采用玻片点滴法与双通管进行RNAi干扰实验，相对注射法，减少了虫体的 机械损伤，也大大减少dsRNA的用量，另外，本实验构建了 dsRNA大肠杆菌的体外表达载体， 从而减少实验费用，简化了实验操作，解决了实验dsRNA量不足的关键。最终通过点滴实验 验证了 AK基因的RNAi对叶螨具有致死效果，建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提 供新的实验手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0054] 图I dsRNA合成电泳图，泳道I :Marker，泳道2、3 :AK的dsRNA ;图2不同浓度的 dsRNA干扰后虫体的校正死亡率。
[0055] 图3,土耳其斯坦叶螨在不同处理不同时间的存活率 具体的实施方式
[0056] 实施例1
[0057] I. AK基因片段的克隆方法：
[0058] (1)取叶螨100-150头，用TRIzol法提取总RNA ;
[0059] (2)合成cDNA第一条链；
[0060] (3)从叶螨转录组中获取基因片段序列，在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/进行 同源性比对之后，预测为AK基因，利用Primer premier 5. 0软件设计Pl和P2,以RT-PCR 方法进行扩增；
[0061] 上游引物（Pl) :5' GCGACTTGTGAACCTG 3' （SEQ ID NO. 2)，
[0062] 下游引物（P2) :5，TCTGCTGACGCTGAAA 3' （SEQ ID NO. 3);
[0063] PCR 反应程序为：94°C变性 5min，94°C lmin，56°C lmin，72°C lmin，32 个循环，72°C 延伸。
[0064] PCR 反应体系（25 μ L):
[0065] IOXEx PCR Buffer 2. 5 μ L 2. 5mM dNTP Mixture 2. 0 μ L cDNA 模板 3 μ L
[0066] 10 μ M 上游引物 Pl LOuL 10 μ M下游引物Ρ2 LOuL 5U/μ L Ex Taq 0.25 μ L ddH20 15.25 μ L 总体积 25 μ L
[0067] (4) PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；
[0068] (5)将回收的目标片段在Τ3连接酶作用下插入至pMDIS-T载体中，转化到大肠杆 菌HD115(DE)，涂于含氨苄青霉素 lOOyg/ml的LB培养基，37°C培养，过夜；
[0069] (6)通过菌液PCR，筛选阳性重组子；
[0070] (7)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；
[0071] (8)全自动序列仪进行测序（由上海生工生物工程技术服务有限公司完成），即可 得到SEQ IDNO. 1所示的核苷酸序列的AK基因片段。
[0072] 实施例2.重组质粒载体的构建及其dsRNA的表达
[0073] (1)提取本发明第一方面中克隆的重组质粒PMD18-T-AK，用HindIII和SacII进 行双酶切，获得两个黏性末端。
[0074] (2)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段图X。
[0075] (3)同样用HindIII和SacII对L4440质粒进行双酶切，获得与（1)相同的黏型末 端。
[0076] (4)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段，作为载体图X。
[0077] (5)将（2)所得的目的片段与（4)所得的L4440质粒载体片段用T4DNA连接酶连 接，转化到大肠杆菌HT115中，涂于含有（Amp+Tet)的双抗LB平板，37°C培养，过夜；
[0078] (6)挑取单菌落，接种于2ml LB培养基（Amp+Tet)，37°C过夜培养，抽提质粒并进 行酶切鉴定。
[0079] 选择鉴定正确菌液0· 75ml并加入0· 25ml 80%甘油，-80°C保存
[0080] 将上述保存的含有L4440-AK质粒的HTl 15菌液以I : 100的体积接种于 (Amp+Tet)双抗的 2XYT 培养基中，37°C、250rpm 培养至 OD595 ?0· 4.
[0081] 加入无菌的IPTG至终浓度为0. 4mM于上述菌液，在37°C、250rpm诱导4h。
[0082] 鉴定诱导表达的dsRNA。
[0083] 实施例3. dsRNA点滴法
[0084] (1)将双面胶带剪成2cm长，贴在载玻片一端
[0085] (2)选择健康的雌成螨，用小号毛笔轻轻挑起，将其背部粘在胶带上，注意不要粘 住足、须肢及口器。
[0086] 每片粘30头，排成三排，然后把玻片放在干净无毒且湿润的托盘中，置于28±1°C 下培养箱
[0087] (3)0. 5h后在双目解剖镜下挑去不活泼和死亡个体并补足30头备用；
[0088] (4)用规格2. 5 μ L移液枪在体视显微镜下往每头虫体背面滴加适量dsRNA
[0089] (5)死亡标准：以小号毛笔轻轻触动螨体，附肢不动者为死亡
[0090] (6)连续喂食48h，每24h统计一次死亡率，结果见表1和图2,由表1和图2可见 喂食致死基因 Tubulin的dsRNA能够达到较好的致死效果
[0091] 表 1
[0092]
【权利要求】
1. 叶螨致死基因片段AK，其特征在于序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述的叶螨致死基因片段AK的克隆方法，其特征在于包括如下步骤： ⑴取叶螨，提取总RNA，以提取的叶螨总RNA合成cDNA第一条链； (2) 以步骤（1)合成的叶螨cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO. 2的上游引物 P1、序列为SEQ ID NO. 3的下游引物P2进行RT-PCR扩增； (3) PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段； (4) 将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至pMD18-T载体中，转化到大肠杆 菌HT115,涂于含有氨苄青霉素的LB培养基，37°C培养，过夜； (5) 通过菌液PCR，筛选阳性重组子； (6) 用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒； (7) 全自动序列仪进行测序，得到SEQ ID NO. 1所示的AK基因片段。
3. 根据权利要求2所述的叶螨致死基因片段AK的克隆方法，其特征在于所述的 RT-PCR扩增体系为：反应缓冲液5 ii L，Mg2+4 ii L，dNTP 4 ii L，cDNA模板2 ii L，上游引物 luL，下游引物 liiL，R-Tag 酶 0.5iiL，ddH20 32.5iiL，共 50iiL;PCR 反应程序为：94°C变 性 2min，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，35 个循环，72°C延伸。
4. 重组质粒载体的构建及其dsRNA的表达，其特征包含以下步骤： (1) 将权利要求2中克隆的重组质粒PMD18-T-AK，用Hindlll和SacII进行双酶切，获 得两个黏性末端。 (2) 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段。 (3) 同样用Hindlll和Sac II对L4440质粒进行双酶切，获得与（1)相同的黏型末端。 (4) 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段，作为载体。 (5) 将（2)所得的目的片段与（4)所得的L4440质粒载体片段用T4DNA连接酶连接，转 化到大肠杆菌HT115中，涂于含有（Amp+Tet)的双抗LB平板，37°C培养，过夜； (6) 挑取单菌落，接种于2ml LB培养基（Amp+Tet)，37°C过夜培养，抽提质粒并进行酶 切鉴定。选择鉴定正确菌液〇. 75ml并加入0. 25ml 80%甘油，-80°C保存 (7) 将（6)保存的含有L4440-AK质粒的HT115菌液以1 : 100的体积接种于（Amp+Tet) 双抗的2XYT培养基中，37°C、250rpm培养至0D595 ~ 0? 4. (8) 加入无菌的IPTG至终浓度为0. 4mM于上述菌液，在37°C、250rpm诱导4h。 (9) 鉴定诱导表达的dsRNA。
5. -种叶螨的dsRNA玻片点滴干扰方法，其特征在于包含如下步骤： (1) 将双面胶带剪成2cm长，贴在载玻片一端 (2) 选择健康的雌成螨，用小号毛笔轻轻挑起，将其背部粘在胶带上，注意不要粘住足、 须肢及口器。 (3) 每片粘30头，排成三排，然后把玻片放在干净无毒且湿润的托盘中，置于28土 1°C 下培养箱 (4) 0. 5h后在双目解剖镜下挑去不活泼和死亡个体并补足30头备用 (5) 用规格2. 5 ii L移液枪在体视显微镜下往每头虫体背面滴加适量dsRNA。 死亡标准：以小号毛笔轻轻触动螨体，附肢不动者为死亡。
6. 叶螨dsRNA干扰第二种方法是dsRNA双通管法，主要特征包括： (1) 在玻璃双通管一端先加一块Parafilm封口膜，然后将人工饲料加在其上，再往其上 盖住另一块新的Parafi lm封口膜。 (2) 然后往双通管中放入所要试验的叶螨。 (3) 最后再往玻璃双通管另一端再按第（1)步所述的方法进行操作。 (4) 添加完毕，用针尖向两端的双层Parafilm封口膜上各刺20(视具体情况）个微孔， 以便空气和水分流动； (5) 将叶螨放在人工气候箱饲养，往玻璃管中央盖一块黑布，以使叶螨能去两端吸食人 工饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料。
7.根据权利要求5,或权力要求6所述的dsRNA干扰方法，其特征在于所述的dsRNA为 权利要求4所述的叶螨致死基因片段AK的dsRNA。
【文档编号】C12N15/66GK104404048SQ201210501540
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2012年11月28日 优先权日:2012年11月28日
【发明者】赵伊英, 刘峰, 汪小东 申请人:石河子大学