专利名称：一种蜡样芽孢杆菌菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种蜡样芽孢杆菌菌株，同时还涉及其蜡样芽孢杆菌菌株在抑制烟草黑胫病方面的用途。
背景技术：
烟草是重要的经济作物，也是病害危害最严重的作物之一，从播种到收获，整个过程都可受到病原物的侵染，而引起侵染性病害。烟草黑胚病parasiticavar nicotianae (Breda de Hean) Tuker)是烟草生产危害严重的病害之一,在我国除东北烟区零星发生以外，包括台湾省在内的华南、华中、华东和西北种植烟区均广泛发生，经济损失较为严重。目前生产上一般采用抗病品种、栽培防治、化学防治以及生物防治措施，但由于该病菌的游动孢子形成速度快且数量大，侵染烟株后潜育期短、发病快，在一个生长季节可以发生多次再侵染，同时该病有时还与其它病害混合发生，从而导致一些抗黑胫病品种抗性的丧失；化学防治中化学农药的采用，短期内有效。但长期反复施用，会造成烟株药害、烟株农药残留和病菌对农药的抗药性。生物防治是国际上目前进行植物病害防治的首选防治措施，这种从自然界中分离、筛选有益微生物并用于病原微生物的拮抗、抑制作用的防治方法，具有闻效、无毒、无残留和低成本等特点。
从现有植物病害生物防治的研究报道来看，采用的微生物种类有细菌、真菌、放线菌等微生物。但生防菌种普遍存在着定殖不易，容易受外界条件的影响，如对光、紫外、干燥较为敏感。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种具有抗逆性强、营养要求简单、较稳定、易于定殖，对光和紫外稳定，易产业化、成本较低、储存期长、易于施用等特点，且对烟草有一定的促生长作用的蜡样芽孢杆菌菌株。本发明的另一目的在于提供该蜡样芽孢杆菌菌株在抑制烟草疫霉方面的用途。一种蜡样芽孢杆菌UmiBacillus cereus 1205)，其形态特征:1205菌株在普通琼脂平板培养基上，37 °C，培养36 h，菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm，边缘不整齐呈扩展状，表面粗糙颗粒状似毛玻璃状或蜡状，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.0 1.3 X 3.0 5.0 μ m，成链，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7%NaCl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、麦芽糖发酵阳性 、半固体穿刺试验阳性、酪素水解阳性、VP试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性、吲哚实验阴性、蔗糖发酵阴性、乳糖发酵阴性、甘露醇水解阴性。该菌种已于2012年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉武汉大学),保藏号:CCTCC NO: M2012382，名称为:蜡样芽孢杆菌1205 (.Bacillus cereus1205)。对烟草疫霉有抑制作用的蜡样芽孢杆菌1205 (.Bacillus cereus 1205)的分离步骤:
(I)拮抗菌的分离与纯化:称取采自贵州省毕节市大方县的IOg植烟土样于90mL带有玻璃珠的无菌水中，摇床上160rpm振荡20min,静置5min,吸取土壤悬浮液用无菌水逐级梯度稀释。吸取0.1mL稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板，37°C倒置培养36h，待平板长出菌落后，挑取单菌落纯化，编号保存，待测。(2)拮抗细菌的筛选:采用平板对峙法，倒好燕麦培养基平板，用5mm打孔器打取10% V8汁培养基上的疫霉菌丝块放在平板中央，在其周围距离2.5cm处对称接种待测菌株，以不接菌体的平板为对照。重复三次，在28°C培养箱中培养7天，观察到有一株细菌周围产生了明显的抑菌圈，对烟草疫霉有明显的拮抗效果，挑出此细菌菌株，将之编号为1205。(3)拮抗菌的鉴定:将1205菌株点接在普通琼脂平板上，37 °C，培养36 h，菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm,边缘不整齐呈扩展状，表面粗糙颗粒状似毛玻璃状或蜡状，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.0 1.3 X 3.0 5.0 μ m，成链，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7%NaCl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、麦芽糖发酵阳性、半固体穿刺试验阳性、酪素水解阳性、VP试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性、吲哚实验阴性、蔗糖发酵阴性、乳糖发酵阴性、甘露醇水解阴性。参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》，初步鉴定为芽孢杆菌属。将1205菌株接种于牛肉膏蛋白 胨液体培养基中，160rpm 28°C培养12h，离心收集菌体。采用上海生工Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(细菌)提取基因组DNA。以提取到的DNA为模板，用正向引物
16SF(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
和反向引物16SR(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)对菌株的16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR 条件为:94°C 3min ；94°C 45s，54°C 30s, 72°C lmin，25 个循环；72°C终延伸 5min，4°C停止。PCR产物送由上海生工生物工程股份有限公司测序，长度为1468bp。测序结果在GenBank中与cerews相似性为97%。综合菌落形态、生理生化及分子鉴定,将这一菌株记为腊样芽抱杆菌cereus 1205)。蜡样芽孢杆菌菌株1205抑制烟草疫霉方面的应用:
(I)将活化的1205菌株挑一环接入NYBD培养液(牛肉膏Sg，酵母膏5g，葡萄糖10g，水lL，pH自然，121°C，灭菌45min)中，160rpm 28°C培养48h，作为拮抗效果测定的发酵液。采用平板对峙法，倒好燕麦培养基(燕麦片30g，加入IOL蒸馏水，100°C水浴约lh，8层纱布过滤去渣，再加蒸馏水补足1L，琼脂18g，pH自然，121°C，灭菌30min)平板，用5mm打孔器打取疫霉菌丝块放在平板中央，在其周围距离2.5cm处对称放置三个浸泡过腊样芽孢杆菌cereus 1205)发酵液的滤纸片(直径为5mm),以不加发酵液的为对照，重复三次，在28°C培养箱中培养7天，1205对烟草黑胫病菌的抑菌圈直径达到了20.5mmο
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知:本发明的蜡样芽孢杆菌(feci77心cereus 1205)来源可靠，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，能维持生态平衡，能适应病害生态系统，容易培养和保存，抑制烟草疫霉效果好，在农业方面有很大的应用前景。该技术路线合理，可为大规模工业化生产提供可靠的中试数据和设计依据，实现液体发酵工业化生产腊样芽孢杆菌{Bacillus cereus1205)，为开发相关生物制剂及大田推广奠定基础。
具体实施例方式对烟草疫霉有抑制作用的蜡样芽孢杆菌1205 (.Bacillus cereus 1205)的分离步骤:
(I)供试菌株:烟草黑胚病病原菌-烟草疫霉从ora flicoiiaaae),贵州大
学微生物实验室分离、筛选、鉴定、保存。(2)拮抗菌的分离与纯化:称取采自贵州省毕节市大方县的IOg植烟土样于90mL带有玻璃珠的无菌水中，摇床上160rpm振荡20min,静置5min,吸取土壤悬浮液用无菌水逐级梯度稀释。吸取0.1mL稀释液涂布牛肉膏蛋白胨(牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0g, NaCl5.0g,琼脂20g,水1L，ρΗ7.2，121。。，灭菌45min)平板，37°C倒置培养36h，待平板长出菌落后，挑取单菌落纯化，编号保存，待测。(3)拮抗细菌的筛选:米用平板对峙法，倒好燕麦培养基(燕麦片30g,加入IL蒸馏水，100°C水浴约lh，8层纱布过滤去渣，再加蒸馏水补足1L，琼脂18g，pH自然，121°C，灭菌30min)平板，用5mm打孔器打取10%V8培养基(IOmL V8加去离子水90 mL, CaCO3 0.02g,琼脂2g，pH自然，121°C，灭菌30min)上的疫霉菌丝块放在平板中央，在其周围距离2.5cm处对称接种待测菌株，以不接菌体的平板为对照。重复三次，在28°C培养箱中培养7天，观察到有一株细菌对烟草疫霉有明显的拮抗效果，将这株细菌编号为1205。 将活化的1205菌株挑一环接入NYBD培养液(牛肉膏Sg，酵母膏5g，葡萄糖10g，水1L，pH自然，121°C，灭菌45min)中，160rpm, 28°C培养48h，作为拮抗效果测定的发酵液。采用平板对峙法，倒好燕麦培养基平板，用5_打孔器打取疫霉菌丝块放在平板中央，在其周围距离2.5cm处对称放置三个浸泡过1205发酵液的滤纸片(直径为5mm)，以不加发酵液的为对照，重复三次，在28°C培养箱中培养7天，1205对烟草疫霉的抑菌圈直径达到了 20.5mm。同时，挑取菌落边缘和抑菌带接触部位的菌丝制片，显微观察到烟草疫霉菌丝溶解，断裂，原生质凝结现象。拮抗菌的鉴定:1205在普通琼脂平板培养基上，37 °C，培养36 h，菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm,边缘不整齐呈扩展状，表面粗糙颗粒状似毛玻璃状或蜡状，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.0 1.3 X 3.0 5.0 μ m，成链，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7%NaCl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液 化阳性、麦芽糖发酵阳性、半固体穿刺试验阳性、酪素水解阳性、VP试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性、吲哚实验阴性、蔗糖发酵阴性、乳糖发酵阴性、甘露醇水解阴性。参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽抱杆囷属》，初步鉴定为牙抱杆囷属。
将1205菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0g, NaCl5.0gjJClL，pH7.2)*，160rpm 28°C培养12h，离心收集菌体。采用上海生工Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(细菌)提取基因组DNA。以提取到的DNA为模板，用正向引物
16SF(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
和反向引物16SR(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)对菌株的16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR 条件为:94°C 3min ；94°C 45s，54°C 30s, 72°C lmin，25 个循环；72°C终延伸 5min，4°C停止。PCR产物送由上海生工生物工程股份有限公司测序，长度为1468bp。测序结果在GenBank中与cerews相似性为97%。因此,综合菌落形态、生理生化及分子鉴定，将这一菌株记为腊样芽抱杆菌cereus 1205)。通过对抑菌试验来说明本发明的腊样芽孢杆菌(ifeci77i/5.cereus 1205)的抑制烟草疫霉的用途:
(I)发酵液的制备:
将活化蜡样芽孢杆菌(Mcillus cereus 1205 )菌株挑一环接入NYBD培养液(牛肉膏8g，酵母膏 5g，葡萄糖 10g, 7jC lL，pH7.2，121°C，灭菌 45min)中，160rpm 28°C培养 12h，作为种子液。按3%接种量将1205种子液接入装有50ml NYBD发酵培养液的250ml培养瓶中，280C，160rpm,摇瓶培养48h，得拮抗菌发酵液。(2)用无菌的圆滤纸片(直径5_)，吸取发酵液在酒精灯前略微干燥，轻轻放在接种烟草疫霉的燕麦平板(燕麦片30g，加入IL蒸馏水，100°C水浴约lh，8层纱布过滤去渣，再加蒸馏水补足1L，琼脂18g，pH自然，121 °C，灭菌30min)上，倒置于28°C培养箱培养7天，1205对烟草疫霉的抑菌圈直径达到20.5 mm。
权利要求
1.一种腊样芽孢杆菌1205 {Bacillus cereus 1205),其特征在于所述菌种的保藏号为 CCTCC NO: M2012382。
2.按权利要求1所述的蜡 样芽孢杆菌1205在抑制烟草疫霉方面的用途。
全文摘要
本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌菌株(Bacilluscereus1205)及其用途，其形态特征1205菌株在普通琼脂平板培养基上，37℃，培养36h，菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落大，3-7mm，边缘不整齐呈扩展状，表面粗糙颗粒状似毛玻璃状或蜡状，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.0～1.3×3.0～5.0μm，成链，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7%NaCl的培养。本发明具有抗逆性强、营养要求简单、较稳定、易于定殖，对光和紫外稳定，易产业化、成本较低、储存期长、易于施用等特点，且对烟草有一定的促生长作用。
文档编号C12N1/20GK103087944SQ201210521818
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者张传萍, 李祝, 葛永怡, 黄化刚, 申燕, 胡玮, 高冬冬, 张龙林 申请人:贵州省烟草公司毕节市公司, 贵州大学