专利名称：一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法
技术领域：
本发明属于低聚糖的技术领域，涉及低聚果糖的发酵生产方法，具体涉及一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法。
背景技术：
低聚果糖，又称鹿果低聚糖(Fructooligosaccharides,缩写为F0S),是由I 3个果糖基通过β_1，2糖苷健与蔗糖结合而生成蔗果三糖(Ι-Kestose)、蔗果四糖(Nystose)和鹿果五糖(lF_FructofuranosyInystose)的混合物。FOS具有促进肠道内益生菌，例如双歧杆菌的增殖，排毒清洁肠道，提高人体免疫力，改善脂质代谢，能预防蛀牙，不被消化道吸收利用等优异性能，现被广泛用于保健食品配料中。目前生产低聚果糖有两种方法(1)液体深层发酵法；(2)固定化酶法。这两种方法都是以鹿糖为原料，由β -呋喃果糖苷转移酶(β -Fructofuranosidase)进行果糖基转移反应而合成，蔗糖既是果糖的供应者也是接收者{刘冬梅，于淑娟，李国基，等.一种新型的功能性低聚糖-蔗果低聚糖及其生产方法，食品工业，1998，3 =14-16} 0得到广泛应用的是液体深层发酵法，是指利用能分泌β -呋喃果糖基转移酶的微生物，经过培养后从培养液分离收集菌丝体，将菌丝体投入到含蔗糖、蛋白质、无机盐的复杂转化溶液中，在一定的条件下转化为含有低聚果糖(FOS)的糖浆。液体深层发酵法需要前期投入大量的发酵设备及其附属设备，所生产出来的产品成分复杂，不仅要除去大量的菌丝体，蛋白质和无机盐等杂质，而且还容易发生美拉德褐变，给后期的分离纯化带来诸多的困难，并且易使产品色度加深，影响感官质量。而固定化酶的方法，因为固定后的酶容易游离，且底物和产物要不断穿过载体屏障，产率会受到很大的影响。专利号为01128345. 9的中国发明专利主要利用固定化果糖基转移酶生产低聚果糖，先培养出大量的菌丝体，将菌丝体破壁后将酶分离纯化，再将酶与有机高聚物进行交联固定化后，用分批或柱式反应法进行固定化果糖基转移酶生产低聚果糖。该方法的不足之处是步骤 繁多，酶在固定化过程中非常容易失活，转化率低，由于蔗糖和转化后的产物要穿过固定化的颗粒，传质均匀性受到限制。另外，酶的分离纯化过程复杂且在此过程中酶活性有部分损失，在立体结构环境中不稳定，易失活等缺点，且酶的价格昂贵，造成酶法转化成本较高，这些方面均严重制约了其的工业化应用。
发明内容
本发明针对现有低聚果糖转化的酶制剂及其工艺上的不足，目的在于提供一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法。该种全细胞酶制剂制备方法简单，不涉及到酶的分离纯化。这种全细胞酶制剂具有转化效率高，性能稳定的特点。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案一种黑曲霉是指黑曲霉(Aspergillus niger)F0S_0620，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo. 6640。地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。所述的黑曲霉具有如下性质(I)形态特征该菌株为需氧菌，菌丝为乳白色，孢子为黑色。(2)生理特征最适生长温度为25_30°C，最适合生长pH为5. 5-6. 0，可将蔗糖转化为低聚果糖的酶活，转化率高达99%，能催化生成FOS的含量为55%以上。一种黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的方法，包括以下步骤(I)利用权利要求1所述的黑曲霉F0S-0620制备黑曲霉全细胞；(2)利用上述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖。优选地，所述黑曲霉全细胞的制备，包括如下步骤(I)将黑曲霉孢子接种到种子液体培养基中，接种量为I X IO5个/L 101°个/L，于25V -35°C,转速为100r/min 300r/min的条件下培养16h 24h后的菌体溶液为种子液；(2)以体积比为5 10 :100的比例，将步骤(I)所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于25°C 35°C，转速为100r/min 300r/min的条件下培养16h 24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞溶液；(3)收集步骤(2)所得的黑曲霉全细胞溶液，用无菌的200目 400目的滤布过滤、洗涤、再过滤、干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。优选地，所述的种子液体培养基为20 50g/L蔗糖，3g/L 7g/L麦芽粉或IOg/L 30g/L玉米粉，5g/L 10g/L蛋白胨和50g/L 100g/L酵母提取物中的一种或两种，lg/L 3g/L NaCl和lg/L 2g/L NaNO3中的一种或两种。优选地，所述的产酶诱导剂为蔗糖、淀粉、无机盐和酵母提取物中的两种以上的混合物，所述无机盐为K2HP04、MgSO4. 7H20和NaNO3中的一种或两种以上的混合物。优选地，所述的含产酶诱导剂的液体培养基为10g/L 70g/L蔗糖，15g/L 55g/L 玉米粉,20g/L 50g/L 酵母提取物，0g/L 12g/L K2HPO4,0g/L 1. 5g/LMgSO4. 7H20，3g/L 10g/L NaNO30优选地，步骤(3)所述洗涤采用的是NaCl生理盐水溶液，所述干燥为真空冷冻干燥或真空干燥。优选地，所述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的步骤如下(I)以重量体积比为广10 :100 (m/V)的比例，将所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系中，于PH5. 0-7. 0，温度45°C 55°C，转速为100r/min 300r/min的条件下进行转化24h 48h ；(2)转化完成后，过滤转化液，回收黑曲霉全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩，即制得低聚果糖。优选地，所述FOS转化体系的pH是用Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04系列缓冲液调节。优选地，所述FOS转化体系是重量百分比为40%_60%的蔗糖溶液。
本发明与现有的技术相比，具有如下的优点(I)本发明制作方法简单，不涉及到酶繁杂分离纯化的过程，简化了设备的投资。(2)黑曲霉所需要的营养低，易培养，易操作，制作工艺简单，细胞体相当于酶的天然保护层，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步骤。
(3)简化了低聚果糖的生产工艺，直接将黑曲霉全细胞投入到转化液中，减少了液体深层发酵培养中发酵罐及其附属设备的投入。(4)将黑曲霉全细胞投入到FOS的转化体系中，所得的FOS糖液不需要经过脱色，不需要经过离子交换柱脱盐，只需要经过简单的过滤，浓缩后即可得到固形物中的总低聚糖的含量> 50%的FOS糖浆，符合GB/T23528-2009低聚果糖中的非强制性国家标准，整个工艺简单，操作方便，生产成本明显降低。
图1为本发明实施例1利用黑曲霉全细胞催化生产得到的FOS糖浆的HPLC图。图2为本发明黑曲霉全细胞催化生产FOS糖浆的工艺流程图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。实施例1第一步将黑曲霉F0S-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为I X IO5个/L,于33°C,转速为150r/min的摇床上培养16h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基为20g/L蔗糖，30g/L玉米粉，100g/L酵母提取物，2g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步以体积比为5 :100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于33°C，转速为150r/min的条件下培养24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；含产酶诱导剂的液体培养基为70g/L蔗糖，20g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，3g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的200目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。第四步以重量体积比为1:100 (m/V)的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比50%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为5. O、于温度为45°C和转速为150r/min的条件下进行转化24h。第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的方法，利用高压色谱法检测FOS糖浆中低聚果糖的含量，如图1所示，其中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的出峰时间分别为13. 944min、19. 044min 和 26. 063min，百分比分别为 27. 31%,24. 43% 和 3. 78%,所得糖浆中低聚果糖(FOS)的总含量(占干物质)为55. 52%，果糖、葡萄糖和蔗糖的出峰时间分别为7. 084min、7. 746mi n 和 9. 538min，百分含量分别为 4. 11%, 26. 76% 和 13. 61%。实施例2第一步将黑曲霉F0S-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为I X 101°个/L，于28°C，转速为lOOr/min的条件下培养24h后的菌液为种子液；所述种子液体培养基为50g/L蔗糖，7g/L麦芽粉，10g/L蛋白胨，3g/L的NaCl ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用;第二步以体积比为10 :100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于28°C，转速为100r/min的条件下培养16h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述含产酶诱导剂的液体培养基为70g/L蔗糖，35g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，12g/L K2HPO4,1. 5g/LMgS04. 7H20,10g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的400目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。第四步以重量体积比为1:100 (m/V)的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比60%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为6. O、于温度55°C和转速为200r/min的条件下进行转化24h。第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖(FOS)的总含量(占干物质)为55. 30%。实施例3第一步将黑曲霉F0S-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为I X IO6个/L，于25°C，转速为120r/min的条件下培养20h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基为30g/L蔗糖，5g/L麦芽粉，7g/L蛋白胨，50g/L的酵母提取物，1.5g/L NaCl，1.5g/LNaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步以体积比为8 :100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于25°C， 转速 为300r/min的条件下培养20h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述含产酶诱导剂的液体培养基为10g/L蔗糖，50g/L酵母提取物，20g/L玉米粉，6g/L K2HPO4,0. 5g/L MgSO4. 7H20,6. 5g/L NaNO3 ;搅拌溶解均勻后用灭菌,冷却后备用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的300目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。第四步以重量体积比为5 :100 (m/V)的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比40%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为7. O、于温度50°C和转速为300r/min的条件下进行转化36h。第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖(FOS)的总含量(占干物质)为55. 12%。实施例4第一步将黑曲霉F0S-0620的孢子接种到液种子液体培养基中，接种量为IXlO7个/L，于35°C，转速为200r/min的条件下培养18h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基为40g/L蔗糖，10g/L玉米粉，3g/L麦芽粉，5g/L蛋白胨，70g/L酵母提取物，2g/LNaCl，1. Og/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步以体积比为7 :100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于30°C，转速为200r/min的条件下培养18h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述含产酶诱导剂的液体培养基为50g/L蔗糖，40g/L酵母提取物，55g/L玉米粉，3. 5g/L K2HPO4,0. 8g/L MgSO4. 7H20, 5. 5g/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的250目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。第四步以重量体积比为8 :100 (m/V)的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比55%蔗糖溶液中，将FOS该转化体系pH调为7. O、于温度48°C和转速为100r/min的条件下进行转化30h。第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖(FOS)的总含量(占干物质)为55. 47%。实施例5第一步将黑曲霉F0S-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为I X IO8个/L，于30°C，转速为300r/min的条件下培养24h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基为45g/L蔗糖，20g/L玉米粉，7. 5g/L蛋白胨，60g/L酵母提取物，1. 2g/LNaCl, lg/LNaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步以体积比为9 :100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于35°C，转速为250r/min的条件下培养24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为45g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，35g/L玉米粉，9. Og/L K2HPO4,1. 0g/LMgS04. 7H20，5. Og/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用;第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的350目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。第四步以重量体积比为7 :100 (m/V)的比例，将第三步所得黑曲霉全细胞置于为重量百分比53%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为5. 5、于温度47 °C和转速为250r/min的条件下进行转化40h。第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖(FOS)的总含量(占干物质)为55. 60%。实施例6第一步将黑曲霉F0S-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为I X IO9个/L，于29°C，转速为180r/min的条件下培养22h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基配方为358/1蔗糖，158/1玉米粉，58/1麦芽粉，88/1蛋白胨，1.(^/1 NaCl，1.2g/LNaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第二步以体积比为6 :100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于29°C，转速为160/min 的条件下培养24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为60g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，30g/L玉米粉，9. Og/L NaNO3 ;搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的200目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。第四步以重量体积比为9 :100 (m/V)的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比50%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为5. 3、于温度52°C和转速为180r/min的条件下进行转化45h。
第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖(FOS)的总含量(占干物质)为56. 11%。
权利要求
1.一种黑曲霉，其特征在于，所述黑曲霉(Aspergillus niger)F0S_0620，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为 CGMCC No. 6640。
2.一种黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)利用权利要求1所述的黑曲霉F0S-0620制备黑曲霉全细胞； (2)利用上述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉全细胞的制备，包括如下步骤 (1)将黑曲霉孢子接种到种子液体培养基中，接种量为IX IO5个/L 101°个/L，于25V -35°C、转速为100r/min 300r/min的条件下培养16h 24h后的菌体溶液为种子液； (2)以体积比为5 10:100的比例，将步骤(I)所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于25°C 35°C、转速为100r/min 300r/min的条件下培养16h 24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞溶液； (3)收集步骤(2)所得的黑曲霉全细胞溶液，用无菌的200目 400目的滤布过滤、洗涤、再过滤、干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的种子液体培养基为20 50g/L蔗糖，3g/L 7g/L麦芽粉或10g/L 30g/L玉米粉，5g/L 10g/L蛋白胨和50g/L IOOg/L酵母提取物中的一种或两种，lg/L 3g/L NaCl和lg/L 2g/LNaN03中的一种或两种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的产酶诱导剂为蔗糖、淀粉、无机盐和酵母提取物中的两种以上的混合物，所述无机盐为K2HP04、MgSO4. 7H20和NaNO3中的一种或两种以上的混合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的含产酶诱导剂的液体培养基为10g/L 70g/L鹿糖，15g/L 55g/L玉米粉，20g/L 50g/L酵母提取物，0g/L 12g/LK2HPO4,0g/L 1. 5g/L MgSO4. 7H20，3g/L 10g/L NaNO30
7.根据权利要求3或4或5或6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述洗涤采用的是NaCl生理盐水溶液，所述干燥为真空冷冻干燥或真空干燥。
8.根据权利要求2或3或4或5或6所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的步骤如下 (I)以重量体积比为广10 :100m/V的比例，将所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系中，于pH5. 0-7. 0，温度45°C 55°C，转速为100r/min 300r/min的条件下进行转化24h 48h ； (2 )转化完成后，过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩，即制得低聚果糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述FOS转化体系的pH是用K2HPO4AH2PO4系列缓冲液调节。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述FOS转化体系是重量百分比为40%-60%的蔗糖溶液。
全文摘要
本发明公开了一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法，所述黑曲霉(Aspergillus niger)FOS-0620，为需氧菌，孢子为黑色，菌丝为乳白色，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6640。一种黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的方法，包括以下步骤(1)利用权利要求1所述的黑曲霉FOS-0620制备黑曲霉全细胞；(2)利用上述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖。本发明得到的产品经高压液相色谱法检测，低聚果糖的含量(占总固形物)≥50%，本发明的工艺简单，操作方便，酶活性高，转化效率高，具有重要的工业价值。
文档编号C12R1/685GK103045489SQ20121053167
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者刘冬梅, 周康, 范梦珂, 叶嘉伦 申请人:华南理工大学