专利名称：食品及饮料中杏成分实时荧光pcr鉴定方法
技术领域：
本发明属于食品质量控制领域，具体涉及一种食品及饮料中杏成分实时荧光PCR鉴定方法。
背景技术：
杏普遍栽培于世界温带地区，杏原产中国，遍植于中亚、东南亚及南欧和北非的部分地区。杏肉除了供人们鲜食之外，还可以加工制成杏脯、糖杏罐头、杏干、杏汁、杏酒、杏青梅、杏话梅、杏丹皮等；杏仁可以制成杏仁霜、杏仁露、杏仁酪、杏仁酱、杏仁点心、杏仁酱菜
坐寸ο近年来，不断有媒体曝光，一些商家所售卖的杏加工产品(如杏仁露、杏仁饮料等)，其价格明显比商场里的要低很多，甚至比成本价还低。实际上是一些不法商家由于某些杏的成本较高，为了更多的经济利益，便会用假货冒充成本较高的真货销售欺骗消费者，或者在不加入杏成分的前提下，虚假标注产品中含有杏成分。由于国家质监面临无法可依的窘境。也尚无权威的鉴定机构可以对食品或饮料中的杏成分进行鉴定。随着近年来，人们对食品的安全卫生特别重视，食品卫生指标尤其是杏产品中是否真正含有杏等原料的真伪鉴定就显得特别重要。为了尽量减轻假杏产品的不良影响，力求避免人民的合法利益受到侵害，而造成更加不利的影响。由此，急需一种食品及饮料中杏成分简便、快速的检测方法。目前我国在食品及饮料中杏成分检测方法仍是个空白，在保证方法稳定性、特异性等方面存在很多困难，这也是制约方法建立的瓶颈。
发明内容
为了解决上述实际问题，本发明建立了一种食品、饮料中杏成分检测方法研究，进行杏制品检测技术研究。采用TaqMan探针技术，能够对食品或饮料中的杏成分成份进行鉴定。该标准的研制成功及推广应用对提高进出口食品及饮料中的杏成分成份的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验技术具有
重要意义。本发明从以下几个方面研究提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用杏品种的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，直接读取实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和原料中杏成分及其制品的鉴伪检测等，在此基础上，进行了特异性和稳定性检测；本发明的具体技术方案如下本发明所述的杏(Armeniaca vulgaris)为蓄薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)杏属植物(Arm eniaca M ill.)。 全世界杏属植物划分为6个地理生态群和24个区域性亚群,共有10个种。中国有普通杏(A rm eniaca vulgaris Lam·)、西伯利亚杏 A. sibirica(L. ) Lam> 辽杏 A. mandshurica(Maxim. ) Skv.、藏杏 A. holosericea(Betal.)Kost.、紫杏 A. dasy2 carpa(Ehrh. )Borkh. > 志丹杏(A. zhidanensis) C. Ζ· Qiao、梅(A. mume) Sieb.、政和杏(A. zhengheensis) ZhangJ. Y. etLuM. N 与李梅杏(A.1im eisis)Zhang J. Y. etffang Z. M 这 9 个种。本发明的一方面在于公开一种杏成分检测用引物与探针，其包括以下碱基序列杏成分检测引物和探针的设计针对杏核糖体18S rRNA基因序列设计检测用引物与探针。通过GenBank的Blast功能寻找杏核糖体18S rRNA基因(Genebank登录号普通杏AF318756. 1，西伯利亚杏AF318739. 1，辽杏AF318714.1)的同源基因，可见该基因具有很高的种属特异性，其他基因与该基因的同源性很小。据此设计了本发明用于检测的杏成分的检测引物和探针如下杏成分检测引物和探针上游引物5’-TCTGCCTCAACCGATA-3’SEQ ID NO I下游引物5’ -GGCGAACACGAAGAA-3’SEQ ID NO 2探针FAM-5，-CTGTCTCTGCCTATGCCTCCA-3，-TAMRASEQ ID NO 3其中FAM( Carboxyfluorescein,竣基突光素)、TAMRA(CarboxytetramethyIrhodamine,羧基四甲基罗丹明)；本发明的另一方面在于一种杏成分检测试剂盒，其包括上文所述的杏成分检测用引物与探针。本试剂盒中还可以包括阳性对照、阴性对照、空白对照。其中，阳性对照可以选择杏提取的DNA，内参照可以选择真核生物ISSrRNA基因DNA，阴性对照可以选择不含有杏成分的样品提取的DNA，空白对照可以选择灭菌水，也可以每组各设置两个或多个平行的反应体系。其中，质量控制标准为以下条件有一条不满足时，实验视为无效(a)空白对照无荧光对数增长，相应的Ct值〉40. O。(b)阴性对照无荧光对数增长，相应的Ct值〉40. O。(c)阳性对照有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值
<30. O。(d)内参照有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值
<30. O结果判定标准为在符合质量控制标准的情况下，被检样品进行检测时如Ct值(35. 0，则判定为被检样品阳性。如Ct值> 40. 0，则判定为被检样品阴性。如35. O < Ct值< 40. 0，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为< 40. 0，则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ct值> 40. 0，则判定被检样品阴性。本发明的另一方面在于一种杏成分及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其利用上文所述的引物与探针，对样品DNA进行实时荧光PCR方法检测。对于上文所述的杏成分及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，所述的实时荧光PCR方法较优的选择如下①实时荧光PCR反应体系反应体系总体积为25 μ L，其中
权利要求
1.一种杏成分检测用引物与探针，其特征在于，包括以下碱基序列上游引物SEQ ID NO.1下游引物SEQ ID NO. 2探针 SEQ ID NO. 3。
2.一种杏成分实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述杏成分检测用引物与探针。
3.一种杏成分及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其特征在于利用权利要求1所述的引物与探针，对样品DNA进行实时荧光PCR方法检测。
4.根据权利要求3所述的杏成分及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其特征在于利用权利要求1所述的引物，分别对样品按下述方法进行实时荧光PCR检测①实时荧光PCR反应体系反应体系总体积为25 μ L，其中浓度为 IO pg/mL-100 pg/mL 的样品 DNA2 pL.10pmol/L.1:+K游屮物各 ΙμΙ.5 μηιοΙ/L 探针I μ .5 U/pL Taq DNA 聚介_0.5 pL.10 μηιοΙ/L dNTPI pLIOxPCR 缓冲液2.5 pL水16 μ ②实时荧光PCR反应参数95°C，10s，l 个循环；95°C，5s ；52°C,10s ;72°C，34s ;40个循环。
全文摘要
本发明公开了一种杏成分检测用引物与探针、其使用方法及应用。该方法针对杏核糖体18S rRNA基因序列，设计了杏基因的检测用引物和探针，采用实时荧光PCR法对食品及饮料中杏成分的定性检测。本发明所研制的食品及饮料中杏成分的实时荧光PCR法定性检测方法、对提高食品中杏成分的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验技术具有重要意义，具有广阔发展前景。
文档编号C12Q1/68GK103031377SQ20121054364
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者郑秋月, 简中友, 姜丽, 曹际娟 申请人:郑秋月, 简中友, 姜丽, 曹际娟