猪附红细胞体pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪附红细胞体PCR检测方法，依次包括病原的分离纯化，猪附红细胞体DNA的提取，引物的设计与合成，普通PCR的检测，阳性质粒标准品的制备，实时荧光定量PCR的检测的步骤。相对于IHA、ELISA等其他检测方法而言，其特异性高、敏感性强，准确性可靠性大；能快速、简便、可靠、准确的检测出样品中的附红细胞体，也可用于附红细胞体病的流行病学调查和疗效检测。
【专利说明】猪附红细胞体PCR检测方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测附红细胞体病的方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]附红细胞体病(Eperythrozoonsis)是由附红细胞体(Eperythmzoon, EH)寄生于人、动物红细胞表面、血浆及骨髓内，引起的一种以贫血、黄疸、发热等为主要临床症状的人畜共患病。属于立克次体目(Rickettsiales)、无衆体科(Anaplasmata-ceae)、附红细胞体属(Eperythrozoon)。多在红细胞表面单个或成团，呈链状或鳞片状，少量游离。
[0005]猪附红细胞体一般呈环形，直经0.8-2.5um,也有球状、杆状。对干燥和化学药物比较敏感，0.5%石炭酸于37°C经3小时可将其杀死，一般常用浓度的消毒药在几分钟内即可使其死亡，对低温冷冻的抵抗力较强，可存活数年之久。
[0006]附红细胞体对宿主的选择并不严格，人、牛、猪、羊等多种动物均可感染，且感染率比较高。有人做过调查，各种阶段猪的感染率达80-90%;人的感染阳性率可达86%;而鸡的阳性率更高，可达90%，但除了猪之外的其它动物发病率不高。多数隐性，少数发病(受应激因素刺激)， 潜伏期2-45d，病症因动物种类不同而不同，发热，食欲不振，精神萎顿，黏膜黄染，贫血，背腰及四肢末梢瘀血，淋巴结肿大，心悸及呼吸加快；腹泻，生殖力下降，毛质下降，红细胞数减少，血红素、血浆白蛋白、球蛋白均下降，淋巴细胞及单核细胞上升，血红蛋白尿病程长短不一，短者几天，长者数年，严重者死亡。
[0007]该病最早发现于1928年，直到1950年确定猪的黄疸性贫血是由附红细胞体所引起，才逐渐被重视起来。我国于1981年首先在家兔中发现附红细胞体，相继在牛、羊、猪等家畜中查到附红细胞体，以后在人群中也证实了附红细胞体感染的存在。该病不仅导致畜产品质量和产量降低，动物生育力下降，而且还可导致动物发生严重的临床症状甚至死亡，阻碍了畜牧业的发展，造成了重大的经济损失。
[0008]目前对该病的诊断仍多采用镜检的方法，但由于一些人为的因素及该病多呈混合感染，常会发生误诊。临床上该病的诊断方法主要以直接镜检为主，其中包括鲜血压片和涂片染色，但是假阳性率高，动物实验方法是确诊的手段，但所费时间太长，费用高，血清学方法包括间接血凝试验、补体结合试验或酶联免疫吸附试验等，由于附红细胞体的抗体变化起伏较大，这些方法也不适用于该病的诊断，近几年虽然用PCR方法诊断猪附红细胞体病的报道屡见不鲜，但是实际应用过程中，有的仍会表现出不特异和重复性差的现象，加之PCR检测应用的EB为有害物质，因此，也不是非常理想的方法。而实时荧光定量PCR是近年来发展起来的一项新的核酸技术，具有实时、灵敏、快速、安全等优点，在细菌及病毒病的诊断方面已有广泛应用，但国内外尚未见应用实时荧光定量P C R检测猪附红细胞体的报道。
[0009]
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种猪附红细胞体PCR检测方法，能快速、简便、可靠、准确的检测出附红细胞体病，以满足畜牧业生产和医学诊断的需求。
[0011]本发明提供的猪附红细胞体PCR检测方法，包括以下步骤:
(1)病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样lml，4°C或冷冻保存，于每份采集的血样中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min离心10min,去上清液,于沉淀中加入1倍的？1^稀释,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min离心10min,弃沉淀,取上清液于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4°C或一20°C保存备用；
(2)猪附红细胞体DNA的提取，按GenomicDNA purification试剂盒使用说明，从纯化的猪附红细胞体病原及标准阳性病原中提取猪附红细胞体模板，4 °C或一 2 O °C保存备用；
(3)引物的设计与合成,根据GenBank中登录的猪附红细胞体I6 SrRNA序列，用Primerpremier5.0软件设计了 I对特异性引物，预计扩增片段大小为263bp，引物序列为:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '；
(4)普通PCR的检测，通过对引物浓度和退火温度等条件进行优化，最终确定反应体系为:10XPCR 缓冲液 2.5ul，dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 补足至 25ul ;反应条件为:95°C 3min，94°C 30s，56°C 40 s ,72°C 30 s，30个循环，72°C延伸lOmin，取PCR产物5ul，进行琼脂糖凝胶电泳；
(5)阳性质粒标准品的制备，将普通PCR扩增产物纯化后连接到PM D I 8- T载体上，然后转化于DH 5大肠杆菌感受态细胞中，在氨苄青霉素抗性平板上筛选出阳性克隆子，并以此阳性质粒作为标准品，用于实时荧光定量PCR扩增；
(6)实时荧光定量PCR的检测，反应体系为:10XPCR缓冲液2.5ul，2.5mmol/ulMg2+0.2ul, Mg2+ 0.2ul, lOmmol/ul dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul, 20pmol/ul 上、下游引物 PU P2 各 0.5ul，标准品 DNA 2ul, SYBR GreenI 0.3ul，加 ddH20 补足至 25ul ;反应条件为:95°C 3min，94°C 30s, 56°C 40 s ,72°C 30 s，然后 95°C lmin，60°C lmin，75°C 时收集荧光信号，进行40个循环，每个循环升高0.5°C，停留8 s，做熔解曲线。
[0012]本发明提供的猪附红细胞体PCR检测方法，其有益效果在于，提供了一种检测附红细胞体病的标准方法，该方法采用的是实时荧光定量PCR，相对于IHA、ELISA等其他检测方法而言，其特异性高、敏感性强，准确性可靠性大；实时荧光定量PCR所使用的实时定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化平台，它将PCR热循环、荧光检测和各种应用分析软件结合在一 起，可动态地观察PCR每一循环各反应管中PCR产物逐渐增加的情况，具有省时、可重复、灵敏度高和线性范围宽等优点；SYBR GreenI荧光染料在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链D N A相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此通用性好，且价格相对较低，因此本发明建立的检测猪附红细胞体的实时荧光定量PCR更加实用；本发明能快速、简便、可靠、准确的检测出样品中的附红细胞体，也可用于附红细胞体病的流行病学调查和疗效检测。
[0013]
【具体实施方式】
[0014]下面结合一个实施例，对本发明提供的猪附红细胞体PCR检测方法进行详细的说明。
[0015]
实施例
[0016]本实施例的猪附红细胞体PCR检测方法，包括以下步骤:
(1)病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样lml，4°C或冷冻保存，于每份采集的血样中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min离心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀释,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min离心10min,弃沉淀,取上清液于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4°C或一20°C保存备用；
(2)猪附红细胞体DNA的提取,按GenomicDNA purification试剂盒使用说明，从纯化的猪附红细胞体病原及标准阳性病原中提取猪附红细胞体模板，4 °C或一 2 O °C保存备用； (3)引物的设计与合成,根据GenBank中登录的猪附红细胞体I6 S rRNA序列，用Primerpremier5.0软件设计了 I对特异性引物，预计扩增片段大小为263bp，引物序列为:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '；
(4)普通PCR的检测，通过对引物浓度和退火温度等条件进行优化，最终确定反应体系为:10父？0?缓冲液2.5111，dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 补足至 25ul ;反应条件为:95°C 3min，94°C 30s，56°C 40 s ,72°C 30 s，30个循环，72°C延伸lOmin，取PCR产物5ul，进行琼脂糖凝胶电泳；
(5)阳性质粒标准品的制备，将普通PCR扩增产物纯化后连接到PM D I 8- T载体上，然后转化于DH 5大肠杆菌感受态细胞中，在氨苄青霉素抗性平板上筛选出阳性克隆子，并以此阳性质粒作为标准品，用于实时荧光定量PCR扩增；
(6)实时荧光定量PCR的检测，反应体系为:10XPCR缓冲液2.5ul，2.5mmol/ulMg2+0.2ul，Mg2+ 0.2ul, lOmmol/ul dNTP 2ul,rTaq DNA聚合酶Q 0.25ul, 20pmol/ul 上、下游引物 PU P2 各 0.5ul，标准品 DNA 2ul, SYBR GreenI 0.3ul，加 ddH20 补足至 25ul ;反应条件为:95°C 3min，94°C 30s, 56°C 40 s ,72°C 30 s，然后 95°C lmin，60°C lmin，75°C 时收集荧光信号，进行40个循环，每个循环升高0.5°C，停留8 s，做熔解曲线。
【权利要求】
1.一种猪附红细胞体PCR检测方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样lml，4°C或冷冻保存，于每份采集的血样中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min离心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀释,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min离心10min,弃沉淀,取上清液于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4°C或一20°C保存备用； (2)猪附红细胞体DNA的提取,按GenomicDNA purification试剂盒使用说明，从纯化的猪附红细胞体病原及标准阳性病原中提取猪附红细胞体模板，4 °C或一 2 O °C保存备用； (3)引物的设计与合成,根据GenBank中登录的猪附红细胞体I6 SrRNA序列，用Primerpremier5.0软件设计了 I对特异性引物，预计扩增片段大小为263bp，引物序列为:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '； (4)普通PCR的检测，通过对引物浓度和退火温度等条`件进行优化，最终确定反应体系为:10XPCR 缓冲液 2.5ul，dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 补足至 25ul ;反应条件为:95°C 3min，94°C 30s，56°C 40 s ,72°C 30 s，30个循环，72°C延伸lOmin，取PCR产物5ul，进行琼脂糖凝胶电泳； (5)阳性质粒标准品的制备，将普通PCR扩增产物纯化后连接到PM D I 8- T载体上，然后转化于DH 5大肠杆菌感受态细胞中，在氨苄青霉素抗性平板上筛选出阳性克隆子，并以此阳性质粒作为标准品，用于实时荧光定量PCR扩增；` (6)实时荧光定量PCR的检测，反应体系为:10XPCR缓冲液2.5ul，2.5mmol/ulMg2+0.2ul, Mg2+ 0.2ul, lOmmol/ul dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul, 20pmol/ul 上、下游引物 PU P2 各 0.5ul，标准品 DNA 2ul, SYBR GreenI 0.3ul，加 ddH20 补足至 25ul ;反应条件为:95°C 3min，94°C 30s, 56°C 40 s ,72°C 30 s，然后 95°C lmin，60°C lmin，75°C 时收集荧光信号，进行40个循环，每个循环升高0.5°C，停留8 s，做熔解曲线。
【文档编号】C12Q1/68GK103865992SQ201210551025
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】张述智, 夏伟, 朱绍辉, 张 浩, 王晓丽, 徐权汗, 李之详, 许团辉 申请人:青岛中仁药业有限公司