专利名称：猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法，为猪大肠杆菌-副猪嗜血杆菌二联弱毒苗的研制提供科学依据与物质基础。
背景技术：
猪大肠杆菌是条件性致病菌，可使猪终年发病，且可致使各年龄段的猪发病，尤其对仔猪的危害异常严重，其所引发的仔猪疾病以黄痢、白痢和水肿病为主；副猪嗜血杆菌病又称为Glasser’ s病，能够引起断奶仔猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等，发病率一般在10% 15%，严重时死亡率高达到50%。这两种病给我国的养猪业带来严重危害并造成极大的经济损失，因此，如何能够快速、高效、持久的控制这两种疾病显得极其紧迫。目前主要依靠抗菌药物、灭活疫苗和亚单位疫苗免疫对这两种疾病进行防治。这些防治方法各有局限抗生素容易诱发耐药性细菌的产生，且对人和动物的健康也产生负面的影响；而灭活疫苗免疫期短，免疫途径单一，激发免疫机制单一(主要激发的是体液免疫)，需进行多次免疫接种，易导致猪只产生应激；亚单位疫苗免疫原性较差，有些甚至是半抗原，需要与蛋白质载体偶联后使用，技术要求甚高，造价昂贵，不适合大规模生产和使用，所以，现行防治方法对此两种细菌所致疫病的防控不是最佳选择。减毒活疫苗的提出和应用，为防控细菌疫病提供了重要的方法。减毒活疫苗也称活疫苗，具有用量小、副作用轻微、一般只需接种一次、免疫效果好和免疫力持久等诸多优点，它是通过人工培养使病原菌毒力发生变异或由自然界直接筛选出弱毒或无毒的菌株制成，其机体内有一定的生长繁殖能力，可诱导机体发生类似隐性感染或轻症感染，使机体获得特异性免疫力。而微生物原生质体融合技术是研制减毒活疫苗的基础和关键。原生质体融合也称细胞融合、细胞杂交或体细胞杂交，是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。原生质体 融合是指细胞去除细胞壁后，用物理或化学方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。1953年weibullc用溶菌酶处理巨大芽抱杆菌并获得原生质体，首次提出原生质体概念。Karski在1960年的实验研究中发现两种不同类型的动物细胞混合培养中出现自发融合现象。1974年FerenczyL等用离心力诱导法使白地霉营养缺陷型突变株的原生质体发生融合。1976年schaefferP等用PEG成功的诱导出枯草芽抱杆菌种内株间的原生质体融合菌株。1977年Hopwood等报道，原生质体融合重组有可能实现隐性基因的重组暴露，一些隐性基因可以表达或随机产生新的基因表型。1979年Pesti等首次报道了融合育种可以提高青霉素产量，开创了原生质体融合技术在实际生产工作中的应用。经过以上研究使原生质体融合技术成为微生物育种的一种重要手段，从种内融合扩展到种间融合，并用于实际生产工作中。近年来，该技术广泛用于众多领域，在农业、环保、医药等领域已经取得了许多开创性的研究成果。在预防兽医科学领域也有原生质体融合的相关研究，主要目的是为了把不同免疫原性的菌株集中于同一菌株上，对血清型多而又无交叉免疫保护的病原菌研制多价疫苗时，有利于提高疫苗中单因子的单位抗原含量，达到提高免疫效果的目的。如任涛等报道采用EDTA和溶菌酶处理制备大肠杆菌原生质体，成功获得了 90%以上的原生质体制备率，50°/Γ60%的再生率；黄勤妮等对大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的原生质体融合进行了研究，获得了融合菌原生质体的再生；还有诸如禽巴氏杆菌双型融合株、禽巴氏杆菌与大肠杆菌的双型融合株、禽大肠杆菌双型融合株、不同血清型的鸭大肠杆菌融合株、鸭疫里氏杆菌双耐药融合菌株、鸭疫里氏杆菌与鸭大肠杆菌的融合株等研究成果的文献报道。综上所述，利用微生物原生质体融合技术，可以将不同的种的细菌融合在一起，构建成一种杂合菌株，在疫病防控中具有重要的意义和价值。但是以上所做的研究都是基于禽病的研究，目前国内外尚未见到针对猪病进行原生质体融合技术的运用。我们在反复试验后，成功的进行了猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌融合菌株的构建，这也为研制一种新型的猪大肠杆菌一副猪嗜血杆菌融合二联弱毒苗提供了科学依据与理论指导。
发明内容
副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病和猪大肠杆菌引起的猪大肠杆菌病是危害养猪业的两大细菌性传染病。目前针对这两种病的预防主要靠抗菌药物和灭活疫苗或亚单位疫苗免疫。鉴于抗菌药物与灭活苗、亚单位苗存在的局限和不足之处，本发明对副猪嗜血杆菌和猪大肠杆菌原生质体进行融合，得到既具有副猪嗜血杆菌抗原又具有猪大肠杆菌抗原的融合菌株，为研制副猪嗜血杆菌一猪大肠杆菌融合菌株二联弱毒苗打下了基础。本发明的技术方案如下猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法，包括如下具体步骤1.培养菌株将副猪嗜血杆菌HPS按5%的接种量接种到TSB液体培养基中，猪大肠杆菌E. coli按5%的接种量接种到普通肉汤中，37°C摇床振荡培养，副猪嗜血杆菌HPS培养12h左右，猪大肠杆菌E. coli培养5h左右，停止培养；2.制备原生质体将步骤I培养的菌株4000r/min离心20min,用O. 01mol/L Tris缓冲液离心洗涤菌体2次，再用高渗Tris缓冲液悬浮，副猪嗜血杆菌加入预热的溶菌酶，使其终浓度为
O.lmg/mL, 37°C水浴20min，随后缓慢加入O. lmol/L EDTA溶液使其终浓度为O. 01mol/L,继续37°C水浴保温15min，4°C 3500r/min离心后，用SMM悬浮；猪大肠杆菌E. coli加入预热的溶菌酶，使其终浓度为0. 2mg/mL, 37°C水浴20min，随后缓慢加入0. lmol/L EDTA溶液使其终浓度为0. 01mol/L，继续37°C水浴保温15min，4°C 3500r/min离心后，用SMM悬浮；3.原生质体融合将步骤2制备的原生质体各取0.1mL混合，然后加入质量浓度为40%的PEG4000溶液1. 8mL, 37°C水浴作用90s，立即加入3倍体积的SCM缓冲液稀释，3500r/min离心20min，用SMM悬浮,表面法取样0.1mL加入到含5 10 μ g/ mL的利福平和5 10 μ g/mL的硫酸阿米卡星的高渗完全选择培养基中，37°C，培养48 72h使融合原生质体再生细胞壁并繁殖，长出融合株菌落。本发明的有益效果为本发明所述猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法用微生物原生质体融合技术把不同免疫原性的菌株集中于同一菌株上，对血清型多而又无交叉免疫保护的病原菌研制多价疫苗时，有利于提高疫苗中单因子的单位抗原含量，达到提高免疫效果的目的。实验研究证明，融合后新菌株的毒力比亲本菌株的毒力要大大降低，且融合菌株保留了原亲本菌株的抗原特性。这为研制一种新型的猪大肠杆菌一副猪嗜血杆菌二联弱毒苗提供了科学依据与理论指导。
图1猪大肠杆菌E. coli与副猪嗜血杆菌HPS的生长曲线。图2融合菌株在高渗双抗培养基上培养52小时的菌落形态。图3猪大肠杆菌E. coli在TSA平板上培养28小时的菌落形态。图4融合菌株在TSA平板上培养28小时的菌落形态。图5副猪嗜血杆菌HPS在TSA平板上培养28小时的菌落形态。图6猪大肠杆菌E. coli菌体形态(100X )。图7融合菌株菌体形态(100 X )。
图8副猪嗜血杆菌HPS菌体形态(100X )。图9猪大肠杆菌E. col1、副猪嗜血杆菌HPS、融合菌株外膜蛋白SDS-PAGE检测结果图，其中，M:蛋白质分子量标记；1:大肠杆菌；2 :副猪嗜血杆菌；3 :大肠杆菌和副猪嗜血杆菌的融合菌株。
具体实施例方式以下将结合具体实施例对本发明猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法进一步说明。实施例1猪大肠杆菌E. coli和副猪嗜血杆菌HPS融合亲本耐药菌株的筛选I材料说明1.1 菌株已鉴定的血清型为Oltl7的猪大肠杆菌E. coli和副猪嗜血杆菌HPS由本实验室保存。1. 2主要试剂各种药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司；抗生素利福平、硫酸阿米卡星购自大连美仑生物技术有限公司。1. 3主要培养基普通肉汤；普通琼脂培养基；TSB液体培养基；TSA 培养基。2方法与结果2.1纸片扩散法药敏试验将副猪嗜血杆菌HPS在TSA琼脂平板上37 V复苏18 24h，猪大肠杆菌E. coli在普通琼脂平板上37V复苏12h 18h，挑取单个副猪嗜血杆菌HPS和猪大肠杆菌E. coli菌落分别接种到4mL TSB和普通肉汤液体培养基中，37°C摇床振荡培养。吸取100 μ L上述菌液，无菌条件下分别均匀涂于TSA和普通琼脂平板上，于超净工作台中放置3 5min至菌液基本干燥，然后在每个平板内均匀安放5个不同的药敏纸片，于37°C恒温培养箱中培养24 48h后观察并测量每种药敏试纸片抑菌圈直径，求取均值后，将结果记录于表I。表I药敏试验结果
权利要求
1.猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤 [ 1.培养菌株 将副猪嗜血杆菌HPS按5%的接种量接种到TSB液体培养基中，猪大肠杆菌万.COli按5%的接种量接种到普通肉汤中，37°C摇床振荡培养，副猪嗜血杆菌HPS培养12h左右，猪大肠杆菌E. coli培养5h左右，停止培养；
2.制备原生质体 将步骤I培养的菌株4000r/min离心20min,用O. Olmol/L Tris缓冲液离心洗漆菌体2次，再用高渗Tris缓冲液悬浮，副猪嗜血杆菌加入预热的溶菌酶，使其终浓度为O. lmg/mL,37°C水浴20min，随后缓慢加入O. lmol/L EDTA溶液使其终浓度为O. Olmol/L，继续37°C水浴保温15min，4°C 3500r/min离心后，用SMM悬浮；猪大肠杆菌疋coli加入预热的溶菌酶，使其终浓度为O. 2mg/mL, 37°C水浴20min，随后缓慢加入O. lmol/L EDTA溶液使其终浓度为O. Olmol/L，继续37°C水浴保温15min，4°C 3500r/min离心后，用SMM悬浮；
3.原生质体融合 将步骤2制备的原生质体各取O.1mL混合，然后加入质量浓度为40%的PEG4000溶液1. 8mL，37°C水浴作用90s，立即加入3倍体积的SCM缓冲液稀释，3500r/min离心20min，用SMM悬浮，表面法取样O.1mL加入到含5 10 μ g/mL的利福平和5 10 μ g/mL的硫酸阿米卡星的高渗完全选择培养基中，370C，培养48 72h使融合原生质体再生细胞壁并繁殖，长出融合株菌落。
全文摘要
本发明提供了猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法，用微生物原生质体融合技术把不同免疫原性的菌株集中于同一菌株上，对血清型多而又无交叉免疫保护的病原菌研制多价疫苗时，有利于提高疫苗中单因子的单位抗原含量，达到提高免疫效果的目的。实验研究证明，融合后新菌株的毒力比亲本菌株的毒力要大大降低，且融合菌株保留了原亲本菌株的抗原特性。这为研制一种新型的猪大肠杆菌—副猪嗜血杆菌二联弱毒苗提供了科学依据与理论指导。
文档编号C12N15/03GK103045583SQ20121055363
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者贺东生, 陈瑞爱, 王文豪, 苏丹萍, 张显浩, 刘好鹏, 李冰, 李琳, 罗满林 申请人:广东大华农动物保健品股份有限公司, 肇庆大华农生物药品有限公司