专利名称：一种同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于植物保护领域，特别涉及番茄黄化曲叶病毒、台湾番茄曲叶病毒、广东番茄黄化曲叶病毒和广东番茄曲叶病毒这4种病毒单独或混合侵染引起番茄黄化曲叶病的快速检测方法及试剂盒。
背景技术：
对于番茄黄化曲叶病毒等植物病毒的检测鉴定，现有技术主要有2种血清学检测方法和聚合酶链式反应(PCR)检测鉴定方法。血清学检测方法，主要包括制备抗体、病样制备、包被检测板、加入抗体、加标记的羊抗兔抗体、显色反应等步骤。虽然市场上可以购买到少数植物病毒的商品化抗体，但绝大部分植物病毒的抗体还是需要研究者自己制备；另外，血清学检测时，抗体还会与亲缘关系较近的病毒存在交叉反应，产生假阳性结果。对于上述引起番茄黄化曲叶病的4种病毒尤其如此，它们的外壳蛋白较保守，其抗体与不同病毒间均存在不同程度的血清学交叉反应。因此，事先制备出待检测病毒特异、高效价的抗体是该技术的关键。该技术工作量大，专业性强；同时，该鉴定过程至少需要2天，鉴定时间较长，需要购买特殊设备酶标仪。PCR检测鉴定方法，主要包括根据已知病毒保守序列设计PCR引物、在PCR管中加入反应成分、PCR仪上进行反应及琼脂糖凝胶电泳检测等步骤。该方法较特异、快速、灵敏，成本也较低，需要购买PCR仪。目前利用PCR检测一种病毒需要6小时左右，若检测鉴定4种病毒,至少需要24小时。番爺黄化曲叶病是我国目前番爺生产上重要病害，番爺黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl virus, TYLCV)、台湾番爺曲叶病毒(Tomato leaf curlTaiwan virus,ToLCTWV)、广东番爺黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curlGuangdong virus, TYLCGuV)和广东番爺曲叶病毒(Tomato leaf curl Guangdongvirus,ToLCGuV)等侵染均可引起该病害。由于这些病毒侵染均引起番茄黄化、曲叶症状，无明显差异，加之田间番茄常受2种或2种以上病毒混合侵染，要明确某一病样是哪种或几种病毒侵染引起的，用上述这二种方法中任何一种方法进行检测与鉴定，均需要24小时以上，而且血清学检测方法还难以鉴定到病毒种类。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，这4种病毒分别为番茄黄化曲叶病毒、台湾番茄曲叶病毒、广东番爺黄化曲叶病毒和广东番爺曲叶病毒。本发明的另一目的在于提供实现上述方法的试剂盒。本发明的目的通过下述技术方案实现一种同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，所述病毒分别为番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)、台湾番茄曲叶病毒(ToLCTWV)、广东番茄黄化曲叶病毒(TYLCGuV)和广东番茄曲叶病毒(ToLCGuV)，包括如下步骤(I)设计检测上述病毒的引物，其位置简图见图1。检测番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的引物为TYF和TYR，PCR扩增产物大小为321bp ；TYF : 5 ’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3，；TYR :5，-TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3，；检测台湾番茄曲叶病毒(ToLCTWV)的引物为TWF和TWR，PCR扩增产物大小为209bp ；TWF :5，-TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3，；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ； 检测广东番茄黄化曲叶病毒(TYLCGuV)的引物为TYGF和TYGR，PCR扩增产物大小为 118bp ；TYGF :5’ -TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’ ；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；检测广东番茄曲叶病毒(ToLCGuV)的引物为TGF和TGR，PCR扩增产物大小为81bp ；TGF :5，-TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3，； TGR : 5 ’ -TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3，。(2)采用CTAB方法提取待检病样品的总DNA。(3) PCR 反应以步骤(2)中提取的总DNA为模板，步骤(I)中的4对引物为引物在同一体系中进行PCR反应。(4)结果鉴别将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察，如有321bp大小的特异性条带，即确认病样品是由番茄黄化曲叶病毒侵染引起的；如有209bp大小的特异性条带，即确认病样品是由台湾番茄曲叶病毒侵染引起的；如有IlSbp大小的特异性条带，即确认病样品是由广东番茄黄化曲叶病毒侵染引起的；如有81bp大小的特异性条带，即确认病样品是由广东番茄曲叶病毒侵染引起的；如产生上述2条、3条或4条特异带，则表明病样品分别是由相应的2种、3种或4种病毒混合侵染引起的；如无上述任何特异条带，则该病样品不是4种病毒中任何I种侵染引起的。步骤(3)中所述的PCR反应体系优选为50 μ L反应体系包括2 μ L待检病样品的总DNA、0. 25μ L浓度为5U/y L的Taq DNA聚合酶、5 μ L IOXTaq DNA聚合酶缓冲液(Mg2+浓度为 15mM)、l μ L 浓度 IOmM 的 dNTPs、浓度为 3 μ M 的 TYF、TYR、TWF、TWR、TYGF、TYGR、TGF和TGR 8个引物各1. 5 μ L，灭菌双蒸水29. 75 μ L0步骤(3)中所述的PCR反应的条件优选为94°C预变性8min ;94°C变性30sec、60°C退火45sec、72°C延伸45sec，32个循环；72°C最终延伸lOmin。步骤(4)中所述的琼脂糖凝胶电泳优选为在质量体积百分比为(w/v)1. 5 2. 0%的琼脂糖凝胶上电泳，100 125V恒压电泳35 50min。实现上述方法的试剂盒，包括Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶缓冲液和引物。所述引物分别为
TYF :5’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’ ；TYR :5，-TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3，；TWF :5，-TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3，；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ；TYGF :5，-TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3，；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；TGF :5，-TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3，；TGR : 5，-TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3，。 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)快速简便本发明的方法鉴定周期为4小时内，而且非专业人员均可操作，鉴定方法适应性强；而无论是传统的血清学检测鉴定方法或单一 PCR检测鉴定方法，其周期均较长，二者均至少需要24小时以上。(2)准确本发明是根据4种病毒的基因组序列设计特异的PCR引物，鉴定结果准确可靠；而血清学检测方法，由于本发明所说的4种病毒的外壳蛋白较保守，它们之间或多或少存在血清学反应，实际检测中无法确定一个病样品具体是由哪一种病毒侵染引起的，难以定论。(3)低成本本发明所使用的材料均较低廉，所用的PCR仪目前在国内已很普及，PCR所用的酶、琼脂糖等试剂和药品均是开放式，可以在多家公司购买到，鉴定一个样品的成本在9. 5元以内；血清学检测方法，由于需要每种病毒的特异性抗体，而非专业技术人员难以制备出某一病毒的抗体，如向专业试剂公司购买抗体，其价格十分昂贵，检测一个样本约24元左右。单一 PCR检测，其成本较本发明至少增加4倍。
图1是4种病毒的基因组结构及特异引物位置简图。图2是检测4种病毒侵染引起的番茄黄化曲叶病的工艺流程图。图3是实施例2的PCR产物电泳检测图。图4是实施例3的PCR产物电泳检测图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1引物的设计根据引起番茄黄化曲叶病的4种病毒番茄黄化曲叶病毒(TYLCV，国际GenBank登录号为JQ867092)、台湾番茄曲叶病毒(ToLCTWV，国际GenBank登录号为DQ237918)、广东番茄黄化曲叶病毒(TYLCGuV，国际GenBank登录号为AY602166)和广东番茄曲叶病毒(ToLCGuV,国际GenBank登录号为AY602165)的基因组序列，设计了了 4对特异引物，其位置简图见图1。检测番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的引物为TYF和TYR，PCR扩增产物大小为321bp ；TYF :5’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’ ；
TYR :5’ -TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3’ ；检测台湾番茄曲叶病毒(ToLCTffV )的引物为TWF和TWR，PCR扩增产物大小为209bp ；TWF :5’ -TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3’ ；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ；检测广东番茄黄化曲叶病毒(TYLCGuV)的引物为TYGF和TYGR，PCR扩增产物大小为 118bp ；TYGF :5’ -TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’ ；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；检测广东番茄曲叶病毒(ToLCGuV )的引物为TGF和TGR，PCR扩增产物大小为81bp ；TGF : 5 ’ -TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3，；TGR : 5，-TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3，。实施例2对已知病样品的检测与鉴定已知病样品包括TYLCV、ToLCTWV、TYLCGuV和ToLCGuV单独侵染的病样各I份，TYLCGuV和ToLCGuV混合侵染的番茄病样品I份，另取一份健康番茄样品作对照。检测鉴定4种病毒侵染引起的番茄黄化曲叶病的方法流程图如图2所示。(I)提取番爺样品总DNA用无菌的新刀片从待检样品的叶片上取IOOmg叶组织，液氮研磨成粉末，置1. 5mL离心管中；加入65°C预热的500 μ L番茄病样总DNA提取缓冲液，该缓冲液成分包括2%(w/v) CTAB,1. 4M NaCl、0. 02M EDTA、0. OlM Tris-HCl，使用前加入 O. 2% (v/v)巯基乙醇；置于65°C水浴40分钟；加入500yL氯仿异戊醇(体积比为24:1)，轻轻旋转摇匀，4°C、12000rpm离心15分钟；吸取450 μ L上清液到一支新的1. 5mL离心管中，加入50 μ L的3mol/L NaAc (pH 5. 2)、1000 μ L预冷的无水乙醇，混匀后放置于_20°C 20分钟以上，然后40C、12000rpm离心15分钟；弃上清液，加入ImL 70%乙醇(体积百分比)漂洗沉淀2 3次；4°C、12000rpm离心10分钟；倒去液体，倒置离心管于灭菌的吸水纸，室温下干燥DNA ;加入40 μ L TE缓冲液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，pH 8. 0)，并在37°C中保温直至DNA完全溶解。(2) PCR 反应配制PCR反应体系，50 μ L反应体系包括2 μ L上述番茄样品总DNA溶液、O. 25 μ L浓度为5U/yL的Taq DNA聚合酶、5 μ LPCR IOXTaq DNA聚合酶缓冲液(Mg2+浓度为15mM)、I μ L 浓度为 IOmM 的 dNTPs、浓度分别为 3 μ M 的上述引物(TYF、TYR、TWF、TWR、TYGF, TYGR、TGF和TGR)各1. 5 μ L，加灭菌的双蒸水29. 75 μ L至总体积为50 μ L。PCR 反应条件为94°C预变性 8min，94°C变性 30min、60°C退火 30sec、72°C延伸45sec，32个循环，72°C最终延伸lOmin。(3)结果鉴别PCR反应结束后，取各反应产物10 μ L分别点样于质量体积百分比为(w/v)l. 5%琼脂糖凝胶的点样孔中，进行电泳，125V恒压电泳45min ;在凝胶成像系统中观察，并拍照；根据电泳结果做出判定。电泳结果如图3 所示1 :标准分子量(DL1000);2-6 :以 TYLCV、ToLCTWV、TYLCGuV、ToLCGuV及TYLCGuV和ToLCGuV复合侵染的番茄植株叶片总DNA为模板进行PCR反应结果；7 :阴性对照(以健康番茄植株叶片总DNA为模板进行PCR反应结果)；8 :标准品(以包含4种病毒全长的质粒混合物为模板进行PCR反应结果)。分别以4种病毒单独或混合侵染的番茄病样叶组织的总DNA溶液为模板，可成功地扩增到预期大小为321bp、209bp、118bp和Slbp的特异目的片段，这些片段大小与以标准品为模板扩增出的片段大小一致，而作为对照的健康番茄样品未出现特异扩增条带，说明该检测方法是准确可靠的。实施例3对未知病样品的检测与鉴定试验对来自广东多个地区采集到的10份番茄样品进行取样，共取得10个样品并进行编号，各号样品所对应的采集地点以及症状表现等信息见表I。检测鉴定所采用的方法同实 施例2所用方法相同，并用单一 PCR (单一 PCR反应体系中只分别加入上述4对引物中的I对引物，其余条件与实施例2相同)对每个样品进行检测，加以比较验证。结果如图4及表I所示，图4中M :标准分子量(IOObp梯度)；1 10 :分别为汕头市澄海、广州市增城、肇庆市高要、肇庆市高要、广州市花都、广州市花都、佛山市三水、广州市增城、茂名市信宜和广州市白云等来源的待检样品；11 :标准品(以包含4种病毒全长的质粒混合物为模板进行PCR反应结果)。待检的10个样品中1、2、9号样品中含有ToLCTWV，4、10号样品中含有TYLCGuV，5号样品中含有ToLCGuV，7号样品中含有TYLCV，说明这些病样是由这些病毒分别侵染引起的；而6号样含有TYLCGuV和ToLCGuV，说明是由这2种病毒复合侵染引起的；而3号和8号样品为阴性，即该样品中不含TYLCV、ToLCTWV、TYLCGuV和ToLCGuV 4种病毒，不是由这4种病毒侵染引起的不正常。上述结果与单一 PCR检测结果一致。表I应用本发明方法检测与鉴定不同来源待检番茄样品的结果
样品编号~I症状表现 [HlI检测结果
1黄化、卷曲汕头市澄海 ToLCTWV
2黄化、卷曲广州市增城 ToLCTWV
3轻微黄化肇庆市高要 ~
4黄化、卷曲肇庆市高要 TYLCGuV
5黄化、皱缩广州市花都 ToLCGuV
6黄化、曲叶广州市花都 TYLCGuV+ToLCGuV
7黄化、皱缩佛山市三水 TYLCV
8广州市增城 ~
9黄化、卷曲茂名市信宜 ToLCTWV
10黄化、卷曲广州市白云 TYLCGuV上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之 内。
权利要求
1.一种同时检测引起番爺黄化曲叶病4种病毒的方法,所述病毒分别为番爺黄化曲叶病毒、台湾番爺曲叶病毒、广东番爺黄化曲叶病毒和广东番爺曲叶病毒，其特征在于包括如下步骤(1)设计检测上述病毒的引物检测番茄黄化曲叶病毒的引物为TYF和TYR，PCR扩增产物大小为321bp ；TYF :5’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’ ；TYR :5’ -TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3’ ；检测台湾番茄曲叶病毒的引物为TWF和TWR，PCR扩增产物大小为209bp ；TWF :5’ -TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3’ ；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ；检测广东番茄黄化曲叶病毒的引物为TYGF和TYGR，PCR扩增产物大小为118bp ；TYGF :5’ -TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’ ；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；检测广东番茄曲叶病毒的引物为TGF和TGR，PCR扩增产物大小为81bp ；TGF :5’ -TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3’ ；TGR :5’ -TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3’ ；(2)采用CTAB方法提取待检病样品的总DNA；(3)PCR反应以步骤(2)中提取的DNA为模板，步骤(I)中的4对引物为引物在同一体系中进行PCR反应;(4)结果鉴别将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察，如有321bp大小的特异性条带，即确认病样品是由番茄黄化曲叶病毒侵染引起的；如有209bp大小的特异性条带，即确认病样品是由台湾番茄曲叶病毒侵染引起的；如有IlSbp大小的特异性条带，即确认病样品是由广东番茄黄化曲叶病毒侵染引起的；如有81bp大小的特异性条带，即确认病样品是由广东番茄曲叶病毒侵染引起的；如产生上述2条、3条或4条特异带，则表明病样品分别是由相应的2种、3种或4种病毒混合侵染引起的；如无上述任何特异条带，则该病样品不是4种病毒中任何I种侵染引起的。
2.根据权利要求1所述的同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，其特征在于步骤(3)中所述的PCR反应体系为50 μ L反应体系包括2μ L待检病样品的总DNA、O.25 μ L浓度为5U/y L的Taq DNA聚合酶、5 μ L IOXTaq DNA聚合酶缓冲液、I μ L浓度IOmM的dNTPs、浓度为3μΜ的上述引物各1. 5 μ L、灭菌双蒸水29. 75 μ L0
3.根据权利要求1所述的同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，其特征在于步骤(3)中所述的PCR反应的条件为94°C预变性8min ;94°C变性30sec、60°C退火45sec、72°C延伸 45sec，32 个循环；72°C最终延伸 IOmin0
4.根据权利要求1所述的同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法，其特征在于步骤(4)中所述的琼脂糖凝胶电泳为在质量体积百分比为1. 5 2. 0%的琼脂糖凝胶上电泳，100 125V恒压电泳35 50min。
5.实现权利要求1 4任一项所述的同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶缓冲液和引物； 所述引物分别为TYF :5’ -GACCTGGCCCACATTGTTTTGCCT-3’ ；TYR :5’ -TCAGCAATCTGCCAACGACGCA-3’ ；TWF :5’ -TGTCGTTACGTCGTGGTTCCGT-3’ ；TWR :5’ -AATTCGCAGGCGGAGGGTTGAT-3’ ；TYGF :5’ -TGCGAACTGGTCTCTTCTTCGC-3’ ；TYGR :5，-ACGCAGCACTCAAAAACTGGGCA-3，；TGF :5’ -TTGGTGAGAGAGCACTGTGGGT-3’ ；TGR :5’ -TTCCAAAATGCCTCGTGCGGGA-3’。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测引起番茄黄化曲叶病4种病毒的方法及试剂盒，这4种病毒分别为番茄黄化曲叶病毒、台湾番茄曲叶病毒、广东番茄黄化曲叶病毒和广东番茄曲叶病毒，属于植物保护领域。本发明设计了4对特异引物，通过提取待检病样品的总DNA，以所提DNA为模板、4对特异引物为引物在同一个体系中进行PCR反应，对PCR产物进行检测，根据PCR产物片段大小即可鉴别待检病样品是何种病毒侵染引起。本发明快速简便、准确、成本低，可同时检测出引起番茄黄化曲叶病的4种病毒，可应用到实际生产中，对植物病样进行准确有效地快速检测。
文档编号C12Q1/68GK103014179SQ201210554759
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者何自福, 杜振国, 汤亚飞, 佘小漫 申请人:广东省农业科学院植物保护研究所