专利名称：一种化学生物合成法规模化制备尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法
技术领域：
本发明涉及化学生物合成法规模化制备尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。
背景技术：
尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称NAD)是脱氢酶的辅酶，也称辅酶I，它在糖酵解，糖异生，三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。产物会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH。而NADH则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成ATP。NAD是现代生物催化反应必不可少的辅酶之一，亮氨酸脱氢酶，甲酸氨脱氢酶，葡萄糖脱氢酶都需要NAD的帮助来完成整个反应。因为NAD在人体及动物体内是数量庞大的氧化还原酶的辅酶，所以它还可以用作药物设计的直接模板，或者根据NAD的结构设计酶抑制剂或兴奋剂来间接改变NAD作用酶的活动，或者直接来抑制NAD的生物合成。NAD同时有可能作为未来很重要的一种抗衰老的辅助药物。现代生物研究的热门Sir2蛋白质是一种依靠NAD的脱乙酰酶，它的作用是延长细胞的生命周期(抗衰老)。目前NAD大都是由动植物中提取，存在得率低，成本高，提取难度大的缺点，大大阻碍了现代生物催化技术的发展。目前尚无化学生物法规模化制备NAD，如能以化学生物合成方法规模化生产NAD，具有重大的社会意义及经济效益。化学生物合成方法与传统提取方法相比，能极大地降低成本，提高得率，降低生产难度，从而有力促进现代生物催化技术的发展。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是规模化化学生物合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，使尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的化学生物合成能真正产生经济效益、社会效益。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:一种化学生物法规模化制备尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，以四乙酰核糖，烟酸乙酯为起始原料，经(I)回流反应；(2)低温滴加氨乙醇反应；(3)低温滴加三氯化磷反应；(4)萃取分离纯化后加入细胞液中生物转化为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，再经纯化干燥后得到纯品。本发明中，其中所述的第一步回流反应中，催化剂直接一次性加入。 本发明中，其中所述的第二步氨乙醇滴加反应中，用低于-10°C温度的氨乙醇加入。本发明中，其中所述的第二步反应的温度，控制在-3°c -5°c。本发明中，其中的第二步反应结束后，先在0°C以下回收氨乙醇。本发明中，其中的萃取时先将冰块加入反应液，避免产热过快，破坏产物。本发明中，其中的生物转化后的产品经陶瓷膜微滤或超滤后用模拟移动色谱床或高速逆流色谱或柱层析纯化。本发明中，其中所述的催化剂为三氟甲磺酸甲酯。本发明中，其中所述的回收氨乙醇的方法为在真空度大于-0.099MPa的高真空回
收氨乙醇。本发明中，其中所述的在回收氨乙醇后，回收甲醇，所述回收甲醇的方式为真空回收、薄膜蒸发或分子蒸馏，其中所述的真空回收的方式为采用罗茨真空泵及反应釜机械密封技术真空度大于-0.099MPa的高真空回收甲醇。本发明的优点是:与传统提取方法相比，能极大地降低成本，提高得率，降低生产难度，从而有力促进现代生物催化技术的发展。
图1为本发明的流程图。
具体实施例方式为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例及附图配合详细的说明，说明如下:参见图1，实施例1:`
向一号反应釜内加入四乙酰核糖20千克，用200千克四氢呋喃溶解，再加入烟酸乙酯10千克，直接加入三氟甲磺酸甲酯5千克。升温至产生回流，有回流后开始计时，反应3小时。反应结束后，减压回收溶剂，回收完毕后，加入150千克乙醇溶解。将150千克乙醇抽入到二号反应釜中，开冷冻降温到_5°C。打开液氨钢瓶减压阀门，开始通氨，计量，通入10千克氨后，结束通氨。开冷冻降温到-10°C以下，得低温氨乙醇。将低温氨乙醇滴入一号反应釜中，滴加完毕后，开始计时，精确控制反应温度-3 0C -5 °C，反应48小时。开启罗次真空泵，控制真空度大于-0.099MPa，在0°C以下减压回收氨乙醇，回收完毕后，控制真空度大于-0.099MPa,在20 V以下减压回收乙醇。回收完毕后，向釜内投加150升亚磷酸二乙酯，开始滴加三氯化磷20千克，滴加完毕后开始计时，保持低温反应20小时。反应结束后，向反应釜内投加25千克冰块，再加入150升亚磷酸二乙酯及200千克冰水，萃取出水层，柱层析纯化。HPLC检测，将相对含量为90%以上的尼克酰胺腺单核苷酸水溶液加入到全细胞发酵液中反应24小时，陶瓷膜错流微滤除去固体，再上高速逆流色谱分离，纳滤浓缩到200升，冷冻干燥得到尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸纯品15.1千克。HPLC检测，含量为97.3%。实施例2:向三号反应釜内加入四乙酰核糖100千克，用1000千克二氧六环溶解，再加入烟酸乙酯50千克，直接加入三氟甲磺酸甲酯25千克。升温至产生回流，有回流后开始计时，反应3小时。反应结束后，减压回收溶剂，回收完毕后，加入750千克乙醇溶解。将750千克乙醇抽入到四号反应釜中，开冷冻降温到_5°C。打开液氨钢瓶减压阀门，开始通氨，计量，通入50千克氨后，结束通氨。开冷冻降温到-10°C以下，得低温氨乙醇。将低温氨乙醇滴入三号反应釜中，滴加完毕后，开始计时，精确控制反应温度_3°C -5°C，反应48小时。开启罗次真空泵，控制真空度大于-0.099MPa,在0°C以下减压回收氨乙醇，回收完毕后，用分子蒸馏设备在20°C以下回收乙醇。回收完毕后，向釜内投加750升二甲苯，开始滴加三氯化磷100千克，滴加完毕后开始计时，保持低温反应20小时。反应结束后，向反应釜内投加75千克冰块，再加入750升二甲苯及1000千克冰水，萃取出水层，柱层析纯化。HPLC检测，将相对含量为90%以上的尼克酰胺腺单核苷酸水溶液加入到全细胞发酵液中发酵24小时，陶瓷膜错流微滤除去固体，再用模拟移动色谱床分离，纳滤浓缩到1000升，冷冻干燥得到尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸纯品77.6千克。HPLC检测，含量为98.2%。实施例3:向五号反应爸内加入四乙酰核糖200千克,用2000千克四氢呋喃溶解,再加入烟酸乙酯100千克，直接加入三氟甲磺酸甲酯50千克。升温至产生回流，有回流后开始计时，反应3小时。反应结束后，减压回收溶剂，回收完毕后，加入1500千克乙醇溶解。将1500千克乙醇抽入到六号反应釜中，开冷冻降温到_5°C。打开液氨钢瓶减压阀门，开始通氨，计量，通入100千克氨后，结束通氨。开冷冻降温到-10°c以下，得低温氨乙醇。将低温氨乙醇滴入五号反应釜中，滴加完毕后，开始计时，精确控制反应温度-3°c -5°c，反应48小时。开启罗次真空泵，控制真空度大于-0.099MPa，在0°C以下减压回收氨乙醇，回收完毕后，用薄膜蒸发器在20°C以下减压回收乙醇。回收完毕后，向釜内投加1500升乙酸乙酯，开始滴加三氯化磷200千克，滴加完毕后开始计时，保持低温反应20小时。反应结束后，向反应釜内投加250千克冰块，再加入1500升乙酸乙酯及2000千克冰水，萃取出水层，柱层析纯化。HPLC检测，将相对含量为90%以上的尼克酰胺腺单核苷酸水溶液加入到全细胞发酵液中反应24小时，超滤除去固体，再上树脂柱层析分离得到尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，纳滤浓缩到2000升，冷冻干燥得到尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸纯品155.3千克。HPLC检测，含量为98.1% ο本发明的优点是:与传统提取方法相比，能极大地降低成本，提高得率，降低生产难度，从而有力促进现代生物催化技术的发展，年创造收入五亿元人民币(以年产NAD5000千克，每千克10万元计)，创利税一亿元人民币。本发明以化学生物合成法代替传统的提取法，极大地提高了重要的生物催化酶NAD的生产能力，对世界生化研究制造的推进有极为重要的意义。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发 明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
权利要求
1.一种化学生物法规模化制备尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，以四乙酰核糖，烟酸乙酯为起始原料，经(I)回流反应；(2)低温滴加氨乙醇反应；(3)低温滴加三氯化磷反应；(4)萃取分离纯化后加入细胞液中生物转化为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，再经纯化干燥后得到纯品。
2.根据权利要求1所述的规模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中所述的第一步回流反应中，催化剂直接一次性加入。
3.根据权利要求1所述的规模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中所述的第二步氨乙醇滴加反应中，用低于-10°c温度的氨乙醇加入。
4.根据权利要求1所述的规模化合成尼克酰胺单核苷酸的方法，其中所述的第二步反应的温度，控制在-3 0C -5V。
5.根据权利要求1所述的规模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中的第二步反应结束后，先在o°c以下回收氨乙醇。
6.根据权利要求1所述的规模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中的萃取时先将冰块加入反应液，避免产热过快，破坏产物。
7.根据权利要求1所述的规模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中的生物转化后的产品经陶瓷膜微滤或超滤后用模拟移动色谱床或高速逆流色谱或柱层析纯化。
8.根据权利要求2所述的规模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于:其中所述的催化剂为三氟甲磺酸甲酯。
9.根据权利要求5所述的规模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于:其中所述的回收氨乙醇的方法为在真空度大于-0.099MPa的高真空回收氨乙醇。·
10.根据权利要求1或5所述的规模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于:其中所述的在回收氨乙醇后，回收甲醇，所述回收甲醇的方式为真空回收、薄膜蒸发或分子蒸馏，其中所述的真空回收的方式为采用罗茨真空泵及反应釜机械密封技术真空度大于-0.099MPa的高真空回收甲醇。
全文摘要
本发明涉及一种化学生物合成法规模化制备尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，以四乙酰核糖，烟酸乙酯为起始原料，经(1)回流反应；(2)低温滴加氨乙醇反应；(3)低温滴加三氯化磷反应；(4)萃取分离纯化后加入细胞液中生物转化为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，再经纯化干燥后得到纯品。
文档编号C12P19/36GK103233051SQ20121055512
公开日2013年8月7日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者施自恩, 周少华, 林军, 许康林 申请人:浙江嘉华化工有限公司